实验室条件下活性炭吸附法降低口含烟中烟草特有亚硝胺

高峄涵，郑赛晶，汪阳忠，简小朋，杨 菁，沈 轶*

1. 上海新型烟草制品研究院，上海市大连路789 号 200082

2. 上海烟草集团有限责任公司，上海市长阳路717 号 200082

烟草特有亚硝胺（TSNAs）属于非挥发性亚硝胺，主要存在于烟草和烟气粒相物中［1-2］。TSNAs中有4 种较常见：N-亚硝基降烟碱（NNN）、N-亚硝基新烟草碱（NAT）、N-亚硝基假木贼碱（NAB）和4-（N-甲基亚硝胺基）-1-（3-吡啶基-1-丁酮（NNK），其中NNK 和 NNN 的致癌性较强［3-4］。多年来，烟草及烟草制品中的TSNAs 一直受到科研人员的关注，但具有广泛适用性的降低TSNAs 方法较少。由于烟叶及卷烟烟气成分复杂，TSNAs的结构稳定性差且含量极低，因此选择性吸附烟草及烟草制品中TSNAs 的难度较大［5-7］。

口含烟近年来逐渐成为新型烟草制品领域的研究热点之一。口含烟递送的烟碱也能够满足吸烟者的需求。口含烟中烟草特有亚硝胺的含量较低，但由于NNK、NNN 具有致癌性，其安全性同样受到消费者的关注。全球多个国家或机构对口含烟产品中TSNAs 的含量提出了明确的限量要求。世界卫生组织（WHO）和瑞典食品局（Swedish Food Agency）限量要求是：NNN 和 NNK 的总量≤2 mg/kg（以干质量计）［8］，瑞典火柴（Swedish Match）公司对口含烟产品的质量安全要求是：NNN 和 NNK 的总量≤ 0.95 mg/kg［9］。

目前，国内外常用的控制或降解TSNAs 的方法有3 种：①对口含烟原料进行加热杀菌或微波处理。此方法可有效减少微生物，防止烟叶原料中硝酸盐降解为亚硝酸盐，从而防止TSNAs 含量增加［10-12］，但此方法对调制后烟叶原料中TSNAs含量的影响较小［13］。②在烟叶调制过程中添加对挥发性亚硝胺及TSNAs 合成有明显阻断作用的生物酶制剂［14］。在此方法中，要筛选出耐有机溶剂和耐酸碱、耐高温处理的生物酶体系较难，实验成本较高且反应条件苛刻，不利于实际应用。③采用沸石分子筛、活性炭或介孔氧化硅等吸附性材料，通过液相吸附法降低烟草原料萃取液中亚硝胺等有害成分［15-19］，再将处理后的萃取液用于样品加工过程中。此方法也称离线吸附法，在造纸法再造烟叶的生产过程中较为常用。目前成熟的口含烟生产工艺主要是先对烟草粉末进行含水率和pH 调节，然后在热处理发酵后进行香味调节。在离线吸附法中，烟草粉末需经水浸泡萃取，工艺流程较长，生产成本较高，且产品质量波动较大。对于口含烟来说，目前TSNAs 降低技术存在一定的问题，不适合现有的生产工艺。

在本研究中，采用原位吸附技术，调节烟草粉末的含水率将烟末湿润，使其所含的TSNAs 缓慢释放，然后加入一定比例的活性炭吸附材料，使吸附材料微粉黏附在烟末表面，通过考察不同条件下口含烟中TSNAs 含量的降低幅度，并采用现有口含烟生产工艺对该吸附方法进行模拟应用验证，旨在为降低口含烟中TSNAs 的含量提供方法参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

烟草粉末：晾晒烟（5 级）、白肋烟（B3F）；椰壳活性炭（AC，比利时Chemviron Carbon 公司）；氧化锌改性椰壳活性炭（5%ZnO-AC，本实验室自制）。人乳腺癌细胞MCM-7（细胞No. 115，德国DSMZ 公司）。

标准品：N-亚硝基降烟碱（NNN，≥98%）、N-亚硝基新烟草碱（NAT，≥98%）、N-亚硝基假木贼碱（NAB，≥98%）、4-（N-甲基亚硝胺基）-1-（3-吡啶基）-1-丁酮（NNK，≥98%），氘代-N-亚硝基降烟碱（NNN-d4，≥99%）、氘代-N-亚硝基新烟草碱（NAT-d4，≥99%）、氘代-N-亚硝基假木贼碱（NAB-d4，≥99%）、氘代 -4-（N- 甲 基 亚 硝 胺基）-1-（3-吡啶基）-1-丁酮（NNK-d4，≥99%）（加拿大TRC 公司）。甲醇（色谱纯，泰国RCI Labscan公司）；乙腈（色谱纯，美国Tedia 公司）；乙酸铵（色谱纯，美国Sigma-Aldrich 公司）；乙酸（质谱纯，美国Sigma-Aldrich 公司）；二甲亚砜（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；磷酸缓冲液（PBS；BR，美国Corning 公司）；MTT（噻唑蓝；分析纯，南京合耀生物科技有限公司）；细胞培养液DMEM（美国Mediatech 公司）。除特别要求外，本研究中使用的其他试剂均为色谱纯，水应符合GB/T 6682—2008中一级水的规定。

Agilent 1290 高效液相色谱仪、PTFE 滤头（美国Agilent 公司）；AB5500 三重四极杆液质联用系统（美国AB SCIEX 公司）；Milli-Q50 超纯水仪（美国Millipore 公司）；KQ-700DE 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，功率1 000 W）；CP2245 电子天平（感量 0.000 1 g，德国 Sartorius 公司）；酶标仪（美国Bio-Rad 公司）。

1.2 方法

1.2.1 5%ZnO-AC 制备

将1.0 g 椰壳活性炭AC 颗粒加入10 mL 蒸馏水中，并加入一定量金属盐 Zn（NO3）2，使最终氧化锌负载量为5%；将悬浮液在80 ℃时搅拌2 h 并蒸干，所得样品于100 ℃烘箱中过夜干燥；将所得样品置于卧式管式炉，以5 ℃·min-1速率从室温升温至550 ℃，在氮气流速200 mL·min-1条件下焙烧3 h，得到粉末状5%ZnO-AC 样品。

1.2.2 溶液配制

标准储备液：以甲醇为溶剂，分别配制NNN、NNK、NAT 和 NAB 的质量浓度均为 500 μg·mL-1的标准储备液。内标溶液：以甲醇为溶剂，分别配制NNN-d4，NNK-d4，NAT-d4和 NAB-d4的质量浓度均为4 μg·mL-1的内标储备液。混合标准工作溶液：以甲醇为溶剂，取4 种单一标准储备液及内标溶液配制TSNAs 质量浓度分别为0.010、0.025、0.050、0.100、0.250、0.500、2.500 和5.000 ng·mL-1的八级混合标准工作溶液，其中，内标质量浓度均为10 ng·mL-1。

1.2.3 样品前处理及分析

称取0.5 g 烟末样品置于50 mL 样品瓶中，加入 150 μL 内标溶液和 30 mL 100 mmol·L-1乙酸铵水溶液，振荡萃取45 min；取适量萃取液用0.45 μm PTFE 滤头过滤；取滤液进行LC-MS/MS 分析。液相色谱条件及质谱条件如下：

色谱柱：Waters Xterra MS C18（2.1 mm×50 mm，2.5 μm）；流速：0.22 mL·min-1；柱温：60 ℃；进样量：10 μL；流动相A：水；流动相B：含0.1%（体积分数）乙酸的甲醇；检测时间：10 min；梯度洗脱条件见表1。质谱扫描方式：正离子扫描；离子源：电喷雾电离源（ESI）；检测方式：多反应监测（MRM）；电喷雾电压：3 000 V；离子源温度：550 ℃；离子对的驻留监测时间（dwell time）：100 ms；气帘气压力：241.3 kPa；碰撞气流强度：Medium；雾化气压力：482.6 kPa；辅助气压力：448.2 kPa；入口电压（EP）：10 V；碰撞池出口电压（CXP）：5 V。分析物及内标的定量离子对、定性离子对等质谱参数见表2。

1.2.4 生物碱含量测定

准确称取0.200 g 样品置于15 mL 试管中，加入100µL 内标溶液、1.5 mL 10%（质量分数）NaOH溶液以及3 mL 甲基叔丁基醚，旋紧旋盖，充分振荡5 min；室温放置（24±2）h，取上清液进行GC 分析。GC 分析条件为：

毛细管柱：DB-5（30 m×0.32 mm，1.0 μm）；进样量：1.0 µL，不分流进样；进样口温度：250 ℃；载气：He（99.999%），1.7 mL/min；升温程序：110 ℃下保持5 min，以10 ℃·min-1的速率升至185 ℃，再以6 ℃·min-1的速率升至 250 ℃，保持 10 min；检测器：FID；检测器温度：300 ℃。

1.2.5 活性炭吸附材料细胞毒性检测

向 96 孔板加入 20 μL 含有 5.0×103个细胞的培养基，在体积分数为5%CO2、37 ℃条件下培养24 h。向 96 孔板加入 20 μL 5 mg·mL-1吸附材料的磷酸缓冲液（PBS）分散液，避光孵育 3 h；以100 μL 未加吸附材料溶液的培养基作为对照组。随后，加入 20 μL 质量浓度为 5 mg·mL-1的 MTT 溶液，继续孵育4 h。每孔加入50 μL 二甲基亚砜（DMSO）溶解细胞代谢产生的结晶紫，5 min 后用分光光度法检测570 nm 处的吸光度，并计算细胞活性（以试验组与对照组在570 nm 处吸光度的比值表示细胞活性，其中对照组细胞活性记为100%）。

表1 梯度洗脱条件Tab.1 Gradient elution conditions

表2 各目标化合物的定量离子、定性离子和碰撞能Tab.2 Quantitative ion，qualitative ion and collision energy of each target analyte

1.2.6 活性炭吸附材料原位吸附试验

（1）原位吸附预实验。取100 g 烟末原料，加入蒸馏水调节烟末含水率，按质量分数加入一定量的吸附材料并混合均匀，静置一段时间后取样进行检测。对照组未添加吸附材料。

（2）口含烟生产模拟应用中吸附材料的原位吸附试验。取5 kg 口含烟原料，加入一定比例的盐水和缓冲溶液，调节含水率为35%～45%和pH为7.5 ～8.5；加入4%（质量分数）活性炭微粒，其粒径为400 目（0.037 mm），对照组未添加活性炭微粒，充分搅拌混匀，放入烘箱以82 ℃加热24 h；取出冷却，放入小试生产线包装。取口含烟小包样品进行检测，检测方法同1.2.3 节。

2 结果与讨论

2.1 活性炭添加量对TSNAs 吸附的影响

取3 份烟末各100 mg，分别添加质量分数为3%、5%、10%的AC 并混合均匀，然后将混合物置于小砂芯漏斗中，在避光条件下缓慢加入10 mL蒸馏水，收集滤出液并检测其中TSNAs 含量；对照组未添加吸附材料，其他操作同试验组。由表3可以看出，随着AC 添加量的增加，其对TSNAs 的吸附量明显增加。

表3 不同AC 添加量下烟末冲洗液中TSNAs 的吸附情况Tab.3 Adsorption of TSNAs in tobacco powder washing solutions at different AC addition rates

2.2 活性炭粒径对TSNAs 吸附的影响

本研究中所用椰壳活性炭AC 原始粒径在30目（0.613 mm）左右，为考察AC 粒径对TSNAs 吸附率的影响，将椰壳活性炭研磨，然后选取30 目、60目（0.420 mm）、400 目（0.037 mm）左右的活性炭进行对比。在活性炭添加量为5%、不调节烟末含水率的情况下进行原位吸附试验，结果见表4。由表4 可知：随着 AC 粒径的降低，AC 对 TSNAs 的吸附率从4.8%升至19.1%；活性炭对NNK 有较好的吸附选择性，NNK 吸附率从17.5%升至36.7%。可见，降低活性炭材料的粒径后，其吸附能力增加。

表4 不同粒径AC 材料对TSNAs 的吸附率Tab.4 Adsorption rates of AC materials of different particle sizes to TSNAs

2.3 改性活性炭对TSNAs 吸附的影响

在不调节烟末含水率情况下，分别加入质量分数10%的氧化锌改性前后的椰壳活性炭，充分混匀并取样检测，结果见图1。可以看出，氧化锌改性前后活性炭的吸附性能存在明显差异。5%ZnO-AC 对 TSNAs 的吸附率约为 AC 的 3 倍，并且其对不同组分的吸附选择性也高于AC。可能原因是氧化锌阳离子对N—NO 基团的静电吸引力可提高 5%ZnO-AC 对 TSNAs 的吸附性［20］。

2.4 烟末含水率对TSNAs 吸附的影响

图1 氧化锌改性前后椰壳活性炭对TSNAs 吸附率Fig.1 Adsorption rates of coconut shell AC to TSNAs before and after zinc oxide modification

选取氧化锌改性前后的活性炭吸附材料，在吸附材料添加量为4%、粒径为400 目左右时，考察吸附材料对含水率分别为12%和40%的烟末中TSNAs 的吸附率，结果见图2。可以看出，随着烟末含水率的增大，活性炭材料对TSNAs 的吸附率升高。可能原因是含水率增大有利于TSNAs 的溶出和扩散，进而促进活性炭材料对TSNAs 的更有效吸附。

图2 活性炭材料对不同含水率烟末中TSNAs 的吸附情况Fig.2 Adsorption of AC materials to TSNAs in tobacco powder with different moisture contents

2.5 吸附时间对TSNAs 吸附的影响

为考察吸附时间对烟末中TSNAs 吸附率的影响，向含水率40%烟末中加入质量分数4%、粒径400 目左右的 AC，混合均匀后分别放置 0、3、6、12、24、48 h，然后取样检测，并与未添加活性炭吸附材料的对照组进行对比。结果（图3）表明：随着静置时间的增加，AC 对烟末中TSNAs 的吸附率呈上升趋势，静置6 h 后吸附率为32.7%，48 h 时达到了46.6%。可见，烟末中TSNAs 的溶出需要一定的时间，静置过程中活性炭会不断吸附潮湿烟末中溶出的TSNAs。

对 NNN 和 NNK 的分析结果表明，AC 对 NNK有较高的吸附选择性，如图4 所示。结合图3 和图4 可知：静置 6 h 后，TSNAs 减少 32.7%，而 NNK 和NNN 分别减少58.8%和23.5%；静置48 h 后，TSNAs 减 少 39.5% ，而 NNK 和 NNN 分 别 减 少67.7%和27.5%。

图3 吸附时间对活性炭（AC）TSNAs 吸附率的影响Fig.3 Effect of adsorption time on adsorption rate of activated carbon（AC）to TSNAs

图4 吸附时间对活性炭（AC）的NNN 和NNK吸附率的影响Fig.4 Effect of adsorption time on adsorption rates of activated carbon（AC）to NNN and NNK

2.6 活性炭吸附材料在口含烟生产工艺中的模拟应用

2.6.1 活性炭吸附材料对TSNAs 的吸附率

考虑到活性炭吸附材料的成本和易获得性，在前期条件优化的基础上，选取未改性的AC，在AC 质量分数4%、粒径400 目左右的条件下，进行口含烟生产工艺验证，并将最后的产品与对照组对比，结果如图5 所示。可以看出，与对照组相比，在扣除含水率的影响后，AC 对口含烟中TSNAs 的吸附率达到26.9%，且对NNK 有更好的吸附选择性，吸附率为50.2%。

图5 口含烟生产工艺模拟应用中活性炭（AC）对TSNAs的吸附情况Fig.5 Adsorption of activated carbon（AC）to TSNAs in oral tobacco products in simulation production process

2.6.2 活性炭吸附材料对总生物碱的影响

为考察采用活性炭吸附材料时口含烟中烟碱及次级生物碱含量的降低情况，分析了AC 对生物碱的吸附情况。从表5 可以看出，AC 对总生物碱的吸附率为8.9%。

表5 AC 对生物碱的吸附率Tab.5 Adsorption rates of AC to alkaloids

2.7 活性炭吸附TSNAs 的稳定性

在本研究中，活性炭与烟粉混合后不易分离，为考察TSNAs 被活性炭材料吸附后是否稳定，采用活性炭与TSNAs 标样溶液及纯水体系相互作用进行研究。取1 mL 质量浓度为1 000 ng/mL 的TSNAs 溶液，加水稀释到10 mL（样品1）；加入0.160 g 椰壳活性炭，振荡 30 min，10 000 r/min 离心1 min 取上清液（样品2）；离心后的活性炭用10 mL 去离子水洗 1 遍，10 000 r/min 离心 1 min 取上清液（样品3）；离心后的活性炭用10 mL 去离子水浸泡30 min，10 000 r/min 离心 1 min 取上清液（样品4）。值得注意的是，在进行离心分离时，颗粒较小的活性炭易黏附在管壁上，而颗粒较大的活性炭易分离。检测时，取4 个样品各1 mL，分别加入29 mL 100 mmol·L-1的乙酸铵萃取溶液，并在加入内标后进行分析，结果见表6。由表6 可知：加入活性炭后可吸附溶液90%以上的TSNAs；样品2 中仅含有少量TSNAs 未被活性炭吸附；样品3 中仅有痕量NAT 测出；样品4 中TSNAs 未检出。关于活性炭吸附TSNAs 的时间、温度等条件下的稳定性，还有待进一步深化研究验证。

2.8 活性炭吸附材料的细胞毒性

鉴于口含烟的吸食方式，添加活性炭吸附材料需要考察其安全性，为了检测AC 吸附材料的细胞毒性，本研究中进行了MTT 比色法［21-23］检测人乳腺癌细胞MCM-7 细胞活力的测定。结果显示，添加5 mg·mL-1AC 的PBS 分散液时，试验组细胞活性和对照组相比为117.7%，细胞生长没有受到影响，说明这种活性炭吸附材料无细胞毒性。

表6 活性炭洗脱液中TSNAs 的含量Tab.6 Contents of TSNAs in activated carbon eluent（ng）

3 结论

在实验室条件下，建立了椰壳活性炭原位吸附法降低口含烟中TSNAs 的方法，对椰壳活性炭原位吸附烟草中TSNAs 的条件进行了考察。增加活性炭材料的添加量、降低活性炭材料的粒径、提高烟草粉末的含水率和延长烟草粉末与活性炭吸附材料的接触时间均可提高活性炭对TSNAs 的吸附率。经氧化锌改性后可进一步提高材料对烟末中TSNAs 的吸附率。

在考虑活性炭吸附材料使用的可行性上，结合口含烟生产工艺，初步探索了椰壳活性炭材料在口含烟工艺中的应用。烟草粉末含水率为40%时，加入占烟草原料质量4%、粒径400 目左右的椰壳活性炭，可有效吸附口含烟中25%以上的TSNAs，且吸附材料对口含烟中生物碱的吸附量较小。加入活性炭吸附材料后，不会明显降低口含烟产品的烟碱满足感。

尽管本研究中对所添加的活性炭材料进行了细胞毒性验证，但本研究仅为试验阶段的初步探索，产品的长期使用安全性和消费者接受程度等方面还有待进一步深入研究。