人参总皂苷对高脂模型小鼠的降血脂作用

孙 伟，许桂凤，唐小杭，谷颖敏，章 鑫，谢家骏，顾胜华

（上海中医药大学创新中药研究院，上海 201203）

高脂血症是当今社会一种很常见的慢性疾病，可引起多种严重危害人体健康的疾病，如脂肪肝、动脉粥样硬化、冠心病、下肢动脉闭塞等［1］。目前，临床上预防和治疗高血脂的药物主要是他汀类、贝特类，虽然治疗效果较好，但存在肝肾损伤、肌肉损害等不良反应，天然产物具有毒副作用低等优点，正成为人们关注和研究的热点［2-3］。人参是我国传统名贵中药材，生物活性广泛，人参皂苷是其主要有效成分，临床和动物实验证实其具有抗肿瘤、调节机体免疫功能、抗疲劳、保护心脑血管等多种药理作用［4-5］。近年来研究发现，人参皂苷Re、Rg1、Rg3、Rh1 等有一定的降脂作用［6-7］，但其机制目前尚不明确，而且口服生物利用度低，体内的浓度远远低于体外机制研究中的浓度［8］。因此，本实验将对该成分对高脂血症小鼠的降脂作用进行初步研究。

1 材料

1.1 动物 雄性C57BL／6 小鼠，SPF 级，体质量18～22 g，购自斯莱克实验动物有限公司，生产许可证号SCXK （沪） 2017-0005，饲养于SPF 级动物房，环境温度20～25 ℃，相对湿度（55±15）%，换气次数10～20 次／h。人工控制照明，昼夜交替时间为12 h ／12 h。

1.2 药物 人参总皂苷由吉林大学提供，含有量分别为Rb1 16.6%、Rb2 11.53%、Rc 9.9%、Rd 6.8%、Re 7.6%、Rg1 3.3%、Rg2 0.98%、Rf 1.4%。辛伐他汀［华中海威（北京） 基因科技有限公司，纯度＞99%］。

1.3 试剂 普通饲料购于北京科澳协力饲料有限公司；42%高脂饲料购于帆泊生物技术有限公司。

1.4 仪器 日立7080 全自动生化分析仪（日本日立贸易有限公司）；2-16K 冷冻离心机（美国Sigma公司）；AR2130 电子天平（奥豪斯国际贸易有限公司）；BX51 显微镜（日本奥林巴斯光学株式会社）；全能型脱水机（德国徕卡公司）；FastPrep©快速核酸提取仪（美国Qbiogene 公司）；遗传分析仪（美国应用生物系统公司）。

2 方法

2.1 人参总皂苷对高脂小鼠的降脂作用 小鼠在SPF 级饲养室适应性饲养3 d，按体质量分层，随机区组分为正常对照组、高脂模型组、人参总皂苷低剂量组、人参总皂苷中剂量组、人参总皂苷高剂量组、阳性对照组，每组10 只，每笼5 只。除正常对照组给予普通饲料外，其他组均为高脂饲料，高脂饲料喂养2 周后开始给药，每天灌胃1 次；各组给药剂量分别为低剂量组人参总皂苷100 mg／kg，中剂量组人参总皂苷200 mg／kg、高剂量组人参总皂苷400 mg／kg，阳性对照组辛伐他定20 mg／kg，正常对照组、高脂模型组纯水，连续4 周，每周称定体质量1 次。实验结束前1 d 收集粪便，置于-80 ℃下保存待测。在实验末期小鼠禁食12 h，异氟烷麻醉后经下腔静脉采血、离心，进行血清生化学检查，取出肝脏，称定质量，4%多聚甲醛固定，制作石蜡切片，进行组织病理学检查。

2.2 小鼠粪便细菌群落结构研究 取正常对照组、高脂模型组、人参总皂苷低剂量组、人参总皂苷中剂量组、人参总皂苷高剂量组小鼠粪便，采用Fast DNA 快速提取试剂盒提取其中微生物的基因组总DNA。用通用引物8F 和1492R 作为引物扩增细菌16 s rDNA，其中正向引物8F 的5′端用羧基荧光素（6-carboxyfluorescein，FAM） 标记，PCR 反应的程序为95 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸1.5 min，运行25 个循环；72 ℃延伸10 min。对纯化后的荧光PCR 产物用RsaⅠ进行限制性酶切，酶切反应在37 ℃温育12 h，产物脱盐干燥后用10 μL 超纯去离子甲酰胺溶解，加入0.3 μL Liz 内标混合均匀，进行毛细管电泳和检测，上样体积为10 μL，电泳主要条件为毛细管进样电压为30 kV；进样持续时间为40 s。

2.3 RT-PCR 检测肠道细菌 本实验对几个特定的细菌组分16S rDNA 进行定量PCR，其中8F、518R 作为总体细菌的16S rDNA 的引物，其余各对引物都只能特定扩增某个特定的细菌的群体。用相应的质粒制作每个基因的标准曲线，计算样品中的拷贝数，每个特定的微生物16S rDNA 拷贝数除以总细菌的拷贝数，即为该类细菌的含有量（%）。引物序列分别为总细菌正向5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向5′-GTATTACCGCGGCTGCTGG-3′；Lactobacillus 正向5′-AGCAGTAGG GAATCTTCCA-3′，反向5′-ATTYCACCGCTACACATG-3′；Clostridiumcluster ⅪⅤ正向5′-GAWGAAGTATYTCGGTATG-3′，反向5′-CTACGCWCCCTTTACAC-3′，用特异性的引物PCR 扩增相对应的细菌16S rDNA，PCR 产物与pGEM-T-easy 载体连接后，转化到感受态细胞（E.coliDH5α 细胞） 内。转化子提取质粒，经测序后证实为该类细菌的16S rDNA后即为标准质粒，按照其DNA 的分子量和浓度计算拷贝数，10 倍稀释7 个梯度（1×102～1×108） 制作标准曲线，每个梯度3 个重复，同时作3 个空白对照，进行PCR 反应。

2.4 统计学分析 采用SPSS 16.0 软件进行分析，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD 法。以P＜0.05 为差异有统计学意义。利用SIMCA-P14 软件对小鼠肠道菌群的T-RFLP 数据进行多元统计分析，实验样本首先作为观察变量，内标标准化的峰面积作为响应变量建立数据矩阵，偏最小二乘判别式分析（PLS-DA） 进行数据降维，以主成分描述组间或样本间最大的差异。

3 结果

3.1 人参总皂苷对高脂饲料喂养小鼠体质量的影响 从表1 可以看出，小鼠饲养2 周高脂饲料后，与正常对照组比较其体质量增加（P＜0.05）。第3～6 周，正常对照组小鼠体质量增长最少，高脂模型组最多；人参总皂苷组与高脂模型组比较，小鼠体质量都有下降趋势，并且呈剂量依赖性。

表1 人参总皂苷对小鼠体质量的影响（， n＝10）Tab.1 Effects of total ginsenosides on body mass of hyperlipidemic mice （， n＝10）

注：与正常对照组比较，*P＜0.05；与高脂模型组比较，△P＜0.05。

3.2 人参总皂苷对高脂饲料喂养小鼠血脂及肝功能的影响 从图1 可以看出，高脂模型组小鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C 水平均高于正常对照组（P＜0.05），而人参总皂苷、辛伐他汀均能抑制TC、TG、LDL-C 水平（P＜0.05），并呈剂量依赖性。给药4 周后，人参总皂苷低、中、高剂量分别使小鼠血清TC 水平降低了16.69%、25.86%、30.32%，TG 水平降低了20.49%、35.35%、38.39%，LDL-C水平降低了18.96%、32.26%、40.97%。人参总皂苷灌胃给药4 周后，对小鼠ALT、AST 水平及肝功能无影响，见图2。

3.3 人参总皂苷对高脂饲料喂养小鼠肝细胞脂肪变性的影响 正常对照组小鼠肝脏可观察到肝组织细胞结构正常，排列整齐；高脂模型组小鼠肝脏组织细胞则发现比较明显的脂肪变性，形成大小不等的空泡状脂滴；人参总皂苷能改善高脂饲料引起的肝脏脂肪变性，见图3。

3.4 人参总皂苷对小鼠肠道菌群的作用 从图4可以看出，正常对照组、高脂模型组小鼠肠道菌群的差异较大；人参总皂苷组小鼠肠道菌群结构更接近于正常对照组，尤其是高剂量组。

3.5 人参总皂苷对小鼠肠道细菌的影响 从图5可以看出，高脂模型小鼠肠道细菌不但在群落结构上与正常对照组比较存在差异，在数量上亦然；高脂模型组的肠道细菌数量高于正常对照组（P＜0.05），而人参总皂苷能逆转这种现象，并且呈剂量依赖性。在细菌相对丰度上，产丁酸的Clostridiumcluster ⅩⅣ和益生菌Lactobacillus 在高脂模型动物中减少（P＜0.05），而给予人参总皂苷后两者丰度增加，高剂量下可恢复到正常对照组水平。

4 讨论

由于生活方式、饮食结构的改变，高脂血症的发生率逐渐上升，已经成为严重危害人体健康的因素，可诱发动脉粥样硬化、脂肪肝等多种疾病，因此，安全有效地控制血脂具有非常重要的意义。目前，临床上他汀类药物仍然作为高脂血症的首选，能竞争性抑制细胞内胆固醇合成早期过程中限速酶的活性，抑制胆固醇的生物合成，但长期服用会引起肝肾功能损害、肌肉酸痛等不良反应［9］。

图3 HE 染色观察各组小鼠肝组织病理改变（×200）Fig.3 Observation of hepatic pathological changes of mice in each group by HE staining （×200）

图4 各组小鼠肠道细菌群落结构PLS-DA 散点图Fig.4 PLS-DA scatter plot for structure of mice gut microbiota in each group

图5 各组肠道细菌相对丰度（n＝6）Fig.5 Relative abundance of intestinal bacteria in each group （n＝6）

人参皂苷是补脾益肾中药人参的主要成分，具有抗疲劳、提高机体免疫力等多种作用，多个单一成分的人参皂苷已在研究中证实有良好的降脂作用，而总皂苷的降脂作用则鲜有报道。此外，人参皂苷Rg1 口服生物利用度仅为2.58%［8］，人参皂苷Rb1 的生物利用度1%左右，Rg1 在大鼠体内的达峰浓度（Cmax） 为10.56 μg／mL，而人参皂苷Rg3 在Beagle 犬体内Cmax仅为7.3 ng／mL［10］，人参皂苷Re 更低，为0.939 μg／mL，药物在血液中的最高浓度远远达不到（不及2%） 关于人参皂苷体外降脂作用机制论文中的（＞500 μg／mL）。目前，体外实验提出的作用机制尚不能完全解释人参皂苷口服给药的药效作用，近年来研究发现肠道菌群结构的改变与糖尿病［11］、肥胖［12］、脂肪肝［13］等有密切关系。本研究发现，人参总皂苷具有较好的降脂作用，而在对肠道菌群研究则发现正常对照组和高脂模型小鼠肠道菌群的差异较大，人参总皂苷给药后，小鼠肠道菌群结构更接近于正常对照组，尤其是高剂量给药组，提示肠道细菌可能是人参总皂苷的作用靶点。Cani 等［14］报道，高脂饲料改变了小鼠的肠道菌群结构，内毒素进入体内可引起低度的慢性炎症，从而导致小鼠出现肥胖、高脂、胰岛素抵抗等代谢损伤；本研究发现，高脂小鼠的肠道细菌总量高于正常对照组，细菌总量的增多可能也是代谢内毒素进入体内的一个重要因素，而人参总皂苷可以逆转这个变化，即可能作用于肠道菌群，降低细菌数量，减少代谢内毒素。细菌总量在高脂模型动物中明显升高，但产丁酸的Clostridium clusterⅩⅣ［15］、益生菌Lactobacillus的比例明显减少。丁酸是由结肠内厌氧菌利用低聚糖、非淀粉多糖、抗性淀粉等未消化碳水化合物发酵的产物，为肠上皮细胞的重要能量来源，而人体本身不产生丁酸，Clostridium cluster ⅩⅣ的减少则可引起其降低，导致肠上皮屏障功能失衡，增加细菌内毒素进入体内。本研究初步发现，人参总皂苷可能从改变肠道菌群的结构和数量来发挥降脂作用。