阳春砂仁叶和杆乙醇提取物抑菌作用的比较

曹冠华张 雪陈月月 俞 捷李泽东赵振宇赵荣华*贺 森*

（1.云南中医药大学中药学院，云南昆明 650500； 2.江南大学化学与材料工程学院，江苏无锡 214122；3.中国中医科学院中药资源中心，道地药材国家重点实验室培育基地，北京 100700）

阳春砂仁Amomum villosumLour.是姜科豆蔻属常绿草本植物，其花、果、根、茎、叶均可入药，主产于广东、海南、云南等地［1-2］，始载于《本草拾遗》，是四大南药之一，为历代常用中药［3］，在现代临床上应用广泛，尤其在治疗胃肠道疾病中效果显著［3］。在阳春砂仁、绿壳砂仁和海南砂仁中，以阳春砂仁的品质最好，产量最大，为市场主流产品［4］。研究显示，砂仁是一种良好的天然抑菌剂［5］，但目前对于砂仁抑菌的研究大多数集中在果实上，而对于叶和杆鲜有报道。本研究以阳春砂仁叶和杆为原料，利用滤纸片法［6］研究它们对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抑菌作用，通过测定抑菌圈直径和最小抑菌浓度，比较两者的抑菌效果。本研究变废为宝，大大提高了砂仁叶和杆的附加值，整体增加砂仁种植的经济型。同时也为进一步研究砂仁叶和杆的抑菌成分和在食品、药品工业中的应用奠定了基础。

1 材料

1.1 试剂与药物 砂仁叶和杆采自于云南省红河金平县阳春砂仁基地，由云南中医药大学赵荣华教授鉴定确定为阳春砂仁。大肠杆菌 （Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）由云南大学微生物重点实验室提供。氯化钠（天津市风船化学试剂科技有限公司，批号20180903）；琼脂粉（北京奥博星生物技术有限责任公司，批号20170818）；蛋白胨（北京奥博星生物技术有限责任公司，批号20150522）；酵母粉 （北京奥博星生物技术有限责任公司，批号20170626）；无水乙醇（天津市致远化学试剂有限公司，批号2018110116）。

1.2 仪器 SW-CJ-2D 超净工作台，购自苏州净化设备有限公司；SK7210HP 超声波清洗器，购自上海科导超声仪器有限公司；RRV8V 旋转蒸发仪，购自德国IKA 公司；MJ 恒温恒湿培养箱，购自上海一恒科技有限公司；JJ200精密电子天平，购自美国双杰兄弟 （集团） 有限公司；BioMate 3S 紫外可见分光光度计，购自美国Thermo Fisher公司。

2 方法

2.1 乙醇提取物制备 取砂仁叶和杆洗净，打粉，过60目筛，按1∶10 料液比于80 ℃、70%乙醇中回流提取3 h，共2 次，合并滤液，即得，保存于4 ℃冰箱中备用［7］。提取率＝ （砂仁叶或杆乙醇提取物质量／原料质量） ×100%。

2.2 抑菌活性测定

2.2.1 LB 培养基制备 取蛋白胨10 g、酵母粉5 g、氯化钠5 g、琼脂18 g，加水定容至1 L，适度加热使培养基均匀溶解，调整pH 至7.0～7.2，在高压灭菌锅中121 ℃灭菌20 min。

2.2.2 菌悬液制备 从4 ℃冰箱中取出冷冻保存的菌种，用无菌接种环挑取单菌落，划线接种于平板培养基，在恒温培养箱中37 ℃倒置培养24 h，得单菌落。挑取已活化的单菌落于无菌生理盐水中，制成菌悬液待用［8］。

2.2.3 抑菌圈直径测定 采用滤纸片法［9］。分别取砂仁叶和杆乙醇提取物，用无菌纯水复溶为1 g／mL。打孔器将滤纸打成直径6 mm 的圆纸片，将灭菌干燥后的滤纸片放入不同浓度的提取液中浸泡2 h，用镊子取出，置于含菌平板中，各滤纸片距离均等，同时以浸泡在无菌生理盐水中的滤纸片为空白对照组，每组设3 个重复，恒温恒湿培养箱中37 ℃倒置培养24 h，取出观察，游标卡尺准确测量其抑菌圈直径。

2.2.4 作用研究 分别将砂仁叶和杆乙醇提取物稀释为1、3、10 倍，将直径6 mm 的圆形滤纸片放不同浓度提取液中浸泡2 h。将灭菌好的LB 培养基静置凝固后，在无菌状态下将0.1 mL 大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的菌悬液在平板上涂布均匀，静置待培养基吸取菌液［10］，以浸泡在无菌生理盐水中的滤纸片为空白对照，每个平皿重复3 次，在恒温恒湿培养箱中37 ℃培养24 h，准确测量其抑菌圈直径［11］。

2.3 最低抑菌浓度（MIC） 测定 用对倍稀释法［12］将乙醇提取物稀释至2、1、0.9、0.8、0.7、0.5、0.1 g／mL，各吸取1 mL 于培养皿中，倒入19 mL LB 培养基，在无菌条件下混匀，静置至凝固，制作含有抑菌成分的平板。分别吸取0.1 mL 的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的菌悬液于平板中，均匀涂布，在恒温培养箱中37 ℃下培养24 h，以不加乙醇提取物、只加20 mL LB 培养基的平板作为空白组，升高或降低乙醇提取液浓度，通过观察菌落生长情况来分析细菌MIC，并相应调整浓度。

2.4 统计学分析 采用SPSS 21.0 软件进行分析，GraphPad Prism 5 软件进行作图，数据以（） 表示，多组间比较采用单因素方差分析。以P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 提取率 由表1 可知，砂仁叶的提取率比杆高15.78%，可能是由于杆中纤维太多，不溶于水，用乙醇提取时会产生大量杂质沉淀，使提取率大大下降。

表1 砂仁叶和杆乙醇提取率（%）

3.2 抑菌作用

3.2.1 不同部位 由图1～2 可知，与空白组比较，砂仁叶和杆乙醇提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌均有一定的抑制作用（P＜0.01），叶优于杆。砂仁叶乙醇提取物对于金黄色葡萄球菌的抑菌效果最好，抑菌圈直径为13.12 mm；其次为大肠杆菌，抑菌圈直径为12.42 mm；最弱的为枯草芽孢杆菌，抑菌圈直径为11.54 mm。砂仁杆乙醇提取物对于枯草芽孢杆菌的抑菌效果最好，抑菌圈直径为10.82 mm；其次为大肠杆菌，抑菌圈直径为10.36 mm；金黄色葡萄球菌，抑菌圈直径为9.99 mm。与空白组相比，砂仁叶或杆乙醇提取物抑菌圈直径增大（P＜0.01），但3 种菌之间差异无统计学意义（P＞0.05）。

图1 砂仁叶和杆乙醇提取物抑菌作用

3.2.2 不同浓度 如表2 所示，砂仁叶和杆乙醇提取物1、3 倍稀释液对3 种菌均有抑制作用，10 倍稀释液则无任何效果，而且叶的抑菌圈直径均大于杆。1 倍稀释时，砂仁叶提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最好，抑菌圈直径为11.02 mm；其次为大肠杆菌和枯草芽孢杆菌，抑菌圈直径分别为10.60、9.08 mm，而砂仁杆提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最好，抑菌圈直径为9.49 mm；其次为枯草芽孢杆菌、大肠杆菌，抑菌圈直径分别为8.20、8.79 mm。3 倍稀释时，砂仁叶提取物对大肠杆菌的抑菌效果最好，抑菌圈直径为9.45 mm；其次为金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌，抑菌圈直径分别为7.99、7.45 mm，而砂仁杆提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最好，抑菌圈直径为8.25 mm；其次为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌，抑菌圈直径分别为6.98、7.40 mm。

图2 砂仁叶和杆乙醇提取物抑菌作用

如图3 所示，随着稀释倍数的增大，砂仁叶乙醇提取物对3 种菌的抑菌效果逐渐变差，1 倍稀释液依次为金黄色葡萄球菌＞大肠杆菌＞枯草芽孢杆菌，而3 倍稀释液依次为大肠杆菌＞金黄色葡萄球菌＞枯草芽孢杆菌，当稀释至10倍时无抑菌效果。与空白组相比，1、3 倍稀释液抑菌圈直径变大（P＜0.05）。

表2 不同浓度砂仁叶和杆乙醇提取物抑菌圈直径（mm，， n＝3）

表2 不同浓度砂仁叶和杆乙醇提取物抑菌圈直径（mm，， n＝3）

图3 不同浓度砂仁叶提取物抑菌作用

如图4 所示，随着稀释倍数的增大，砂仁杆乙醇提取物对3 种菌的抑菌效果逐渐变差，1 倍稀释液依次为金黄色葡萄球菌＞大肠杆菌＞枯草芽孢杆菌，而3 倍稀释液依次为金黄色葡萄球菌＞枯草芽孢杆菌＞大肠杆菌，当稀释至10倍时无抑菌效果。与空白组相比，1、3 倍稀释液抑菌圈直径变大（P＜0.05）。

3.2.3 最小抑菌浓度测定 如表3 所示，砂仁叶乙醇提取物对3 种菌的MIC 均低于杆，故前者抑菌效果优于后者。此外，砂仁叶、杆乙醇提取物均对金黄色葡萄球菌有较好的抑菌作用。

表3 砂仁叶和杆乙醇提取物MIC （g／mL）

4 讨论

图4 不同浓度砂仁杆提取物菌抑菌作用

砂仁叶乙醇提取物对金黄色葡萄球菌的抑制效果最佳，砂仁杆乙醇提取物对枯草芽孢杆菌的抑制效果最佳。总体来看，砂仁叶乙醇提取物对3 种菌的抑菌效果均优于砂仁杆乙醇提取物。植物源食品防腐剂安全、天然、抑菌效果好，但其研究与开发还可以进一步加深，如抑菌活性成分或化合物的鉴定和检测、抑菌的机理、量效关系以及食用安全性等方面仍需进一步深入探讨和研究。植物的抑菌等活性成分与植物所生长和分布的情况都有密切的关系，这会导致植物提取液的质量有所差别［13］。本研究以阳春砂仁的叶和杆粗提物进行抑菌效果比较，在提取过程中会导致活性成分损失，因而未表现较强的活性。与另一重要药食两用资源——黄精的抑菌效果相比，效果稍差，这是由于砂仁叶和杆中的成分大部分为挥发油，在提取时容易大量挥发散失，而在黄精中起主要抑菌作用的多糖则相对稳定［14］。砂仁为传统药食两用食材，但其叶和杆在食品领域的利用尚未见报道。云南红河金平砂仁近年来在产量和品质方面远超广东，成为当地农民脱贫致富的主要渠道［15］。但砂仁叶和杆常被遗弃，颇为浪费，若能利用其开发天然抑菌防腐剂，满足食品生产需求，对增加产品附加值具有重要意义。