裸花紫珠UPLC 指纹图谱的建立

邓杰仁杨义芳 李小锋章弘扬吴永忠胡 坪康兴东杨 扬王月荣*肖军平*

（1.华东理工大学化学与分子工程学院，上海市功能材料化学重点实验室，上海 200237； 2.上海药辰生物科技有限公司，上海 200060； 3.江西普正制药有限公司，江西吉安 343100； 4.上海医药工业研究院，上海 200040）

裸花紫珠Callicarpa nudifloraHook.et Arn.是马鞭草科紫珠属植物的干燥地上部分［1］，全年均可采收，具有收敛止血、清热解毒的功效，可用于各种内外出血症，对肺胃之出血尤为多用，也可治疗烧烫伤及热毒疮癌［2］。1977 年版《中国药典》 曾收录裸花紫珠，2015 年版新增中药品种中也收录了该药材［3-4］，对其指纹图谱的建立已有报道［5-8］，但该药材成分复杂，文献方法分离度不够、检测种类偏少，缺乏对其中各指纹峰的鉴定数据。为此，本研究建立裸花紫珠UPLC 指纹图谱，使用二极管阵列检测器（DAD） 和四极杆-飞行时间质谱（Q-TOF-MS） 对其指纹峰进行鉴定，并结合主成分分析用于该药材与其他紫珠属样品的快速鉴别。

1 材料

1.1 仪器 Waters ACQUITY ARCTM超高效液相色谱仪，配有二元高压梯度泵、真空脱气机、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器（美国沃特世公司）；Agilent 1290 超高效液相色谱-6530 四极杆-飞行时间质谱仪，配有二元高压梯度泵、可控温自动进样器、可控温柱温箱、二极管阵列检测器和电喷雾离子源（美国安捷伦公司）；天平（万分之一，瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ-500DE 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试剂与药物 毛蕊花糖苷（批号M-011-170315）、连翘酯苷B （批号L-013-170421） 对照品均购于成都瑞芬思生物科技有限公司；木犀草苷（批号PRF8030242）、咖啡酸（批号PRF7102121） 对照品均购于成都普瑞法科技开发有限公司；木犀草素-4′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、木犀草素-3′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷对照品为实验室自制，纯度均≥98%。15 批裸花紫珠（S1～S15） 经江西普正制药有限公司吴永忠研究员鉴定为马鞭草科裸花紫珠Callicarpa nudifloraHook.et Arn.的干燥叶；5 批紫珠属其他品种药材（S16～S20） 经其鉴定分别为杜虹花C.formosana、广东紫珠C.kwangtungensis、大叶紫珠C.macrophylla、小叶紫珠C.dichotoma、枇杷叶紫珠C.kochiana，密封后保存于阴凉干燥处，具体见表1。乙腈、甲酸（美国ACS 公司，色谱纯）；甲醇（上海泰坦科技股份有限公司，分析纯）；屈臣氏蒸馏水（北京屈臣氏蒸馏水有限公司）。

2 方法

2.1 对照品溶液制备 精密称取毛蕊花糖苷、木犀草苷、连翘酯苷B、咖啡酸、木犀草素-4′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、木犀草素-3′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷对照品适量，80%甲醇溶解，即得（0.5 mg／mL），0.22 μm 微孔滤膜过滤，4 ℃下冷藏备用。

2.2 供试品溶液制备 裸花紫珠粉碎后过40 目筛，称取粉末约0.5 g，置于具塞锥形瓶中，加入80% 甲醇水溶液25 mL，称定质量，超声（500 W、40 kHz） 提取45 min，放冷，用80% 甲醇补足失质量，摇匀，0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

表1 样品信息

2.3 色谱条件 Phenomenex kintex XB-C18色谱柱（2.1 mm×150 mm，1.7 μm）；流动相0.1% 甲酸（A） -乙腈（B），梯度洗脱（0～5 min，8%～14%B；5～15 min，14%B；15～20 min，14%～18% B；20～30 min，18%～22% B；30～40 min，22%～30% B；40～45 min，30%～50% B；45～55 min，45%～60% B）；体积流量0.3 mL／min；检测波长332 nm；柱温45 ℃；进样量2 μL。

2.4 质谱条件 在正、负离子模式下进行，毛细管电压分别为3 500、3 000 V；干燥气温度350 ℃，体积流量10 L／min；雾化气压力30 psi （1 psi ＝6.895 kPa）；毛细管出口电压150 V；m／z50～1 500；扫描速率1 张谱图／s。质量校正液离子分别为m／z121.050 9、922.009 8 （正离子模式） 和m／z112.985 6、1 033.988 1 （负离子模式）。

2.5 样品测定 取15 批裸花紫珠和5 批其他紫珠属药材，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.3”项色谱条件下进样。取代表性样品（S1），在“2.3”“2.4”项条件下进样，记录总离子流图。色谱数据采用Waters Empower3.0软件处理，质谱数据采用Agilent MassHunter 软件处理。

2.6 数据处理 所有裸花紫珠药材的色谱数据导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2012 版），经中位数法进行多点校正，对色谱峰进行自动匹配，生成色谱指纹图谱共有模式作为对照指纹图谱，计算相似度。所有药材共有峰的峰面积导入SIMCA P＋14.0 软件，经Pareto-scaling预处理后进行主成分分析。

3 结果

3.1 特征图谱建立 按“2.2”项下方法制备供试品溶液（S1），在“2.3”项色谱条件下进样，特征指纹图谱见图1，共获得19 个共有指纹峰。其中，木犀草苷（9 号峰）分离度良好，峰面积适中，故确定其作为内参峰。

图1 各成分UPLC 色谱图

3.2 指纹峰鉴定 根据Q-TOF-MS 提供的精确质量数以及DAD 检测器提供的紫外吸收信息，参考相关文献结合可获得的对照品，对19 个指纹峰进行鉴定，结果见表2。由此可知，药材中主要成分为苯乙醇苷类、黄酮类、有机酸类环烯醚萜苷类等。

3.3 方法学考察

3.3.1 精密度试验 精密称取样品粉末 （S1） 1 份（0.5 g），按“2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.3”项色谱条件下连续进样6 次，测得各指纹峰相对保留时间RSD 小于0.2%，相对峰面积RSD 小于1.9%，表明仪器精密度良好。

3.3.2 重复性试验 精密称取样品粉末（S1） 6 份，每份0.5 g，按“2.2”项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.3”项色谱条件下进样，测得各指纹峰相对保留时间RSD 小于0.2%，相对峰面积RSD 小于2.5%，表明该方法重复性良好。

3.3.3 稳定性试验 精密称取样品粉末 （S1） 1 份（0.5 g），按“2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.3”项色谱条件下于0、2、4、6、12、24 h 进样，测得各指纹峰相对保留时间RSD 小于0.2%%，相对峰面积RSD 小于2.8%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

3.4 相似度分析 15 批样品UPLC 指纹图谱及所生成的对照指纹图谱见图2，相似度见表3。由此可知，1～15 号样品的相似度均大于0.960，而16～20 号样品均小于0.770，表明指纹图谱能很好地区分裸花紫珠与其他紫珠属药材。

表2 裸花紫珠成分UPLC-DAD-Q-TOF-MS 鉴定结果

3.5 主成分分析 按“2.6”项下方法处理后，各样品的主成分分析结果见图3。由此可知，15 批样品聚为一类，并与5 批其他紫珠属药材在PC1 轴上明显分开，表明指纹图谱结合化学计量学可快速鉴别裸花紫珠。

图3 15 批裸花紫珠与5 批其他紫珠属药材主成分分析图

4 讨论

4.1 色谱条件筛选 本实验考察了Agilent Eclipse Plus-C18RRHD （2.1 mm × 100 mm，1.8 μm）、Agilent Eclipse Plus-C18RRHD （2.1 mm×150 mm，1.8 μm）、Phenomenex kintex XB-C18（2.1 mm×150 mm，1.7 μm） 色谱柱的分离效果，最终选择分离度最佳的第3 种色谱柱。

考察了不同流动相（甲醇-水、乙腈-水、甲醇-甲酸、乙腈-甲酸）、柱温（30、35、40、45、50 ℃）、体积流量（0.2、0.25、0.3、0.35 mL／min） 的影响。结果表明，采用流动相乙腈-甲酸、柱温45 ℃、体积流量0.3 mL／min 时，各色谱峰分离度良好、基线平稳、系统压力较低，适用于指纹图谱分析。使用DAD 检测器进行紫外全波长扫描，发现在332 nm 波长下色谱基线噪音较低、特征峰响应较高，且色谱峰信息较完全，故选择其作为检测波长。

4.2 提取方法 对提取方式（超声、回流）、提取溶剂（纯水、20% 甲醇、40% 甲醇、50% 甲醇、60% 甲醇、80%甲醇、纯甲醇、纯乙醇）、提取时间 （15、30、45、60、75、90 min）、溶剂体积 （10、25、40、50、65、75 mL）进行考察。最终确定，最佳提取方法为25 mL 80% 甲醇超声45 min。

4.3 化合物鉴定 峰1、2、3、4、5、7、8、10、12、14、16、17 的UV 信号符合苯丙烯酸衍生物光谱特征：220 nm有小峰吸收和肩峰，260 nm 左右有最小吸收峰，260～330 nm 间有一个肩峰，在330 nm 左右有最大吸收峰。峰6、9、11、13、15、18、19 的UV 信号与黄酮类化合物类似：黄酮类化合物的UV 谱通常有2 个吸收带，吸收带Ⅰ位于290～380 nm，是分子中C 环和B 环上的羰基共轭体系的紫外吸收，位于240～280 nm 的吸收带Ⅱ是A 环与C 环上羰基共轭体系的紫外吸收［24］。Q-TOF-MS 测定时发现，这些化合物在正模式下可生成［M＋H］＋、［M＋Na］＋、［M＋NH4］＋、［M ＋K］＋加合离子，而在负模式下可生成［MH］-、［M＋Cl］-、［M＋COOH］-加合离子，由此可以准确推断出化合物的精确分子量和分子式，从而有助于鉴定。通过查阅关于裸花紫珠已有文献，并与以上DAD 及高分辨质谱数据比较，鉴定了19 个指纹峰。

5 结论

本研究建立了裸花紫珠UPLC 特征指纹图谱，利用Q-TOF-MS 和DAD 检测器对19 个指纹峰进行鉴定。指纹图谱结合相似度评价和主成分分析时，可实现裸花紫珠与其他紫珠属药材的区分，并为合理利用该药材提供参考。