山药商品规格及其质量特性分析

马 蕊，王露露，陈随清

（河南中医药大学药学院，河南郑州 450046）

按质论价是中药材商品交易的传统特色，中药材商品规格等级标准是实现按质论价、优质优价的重要依据［1］。目前在我国现行的《七十六种药材商品规格标准》 中，山药的商品规格划分依据为外观性状，但随着中医药现代化的发展，仅依据外观性状已无法满足现实需求，亟需建立能反映中药材内在质量的商品规格等级标准，这是规范中药材市场交易的关键［2-4］。

山药为薯蓣科植物薯蓣Dioscorea oppositaThunb.的干燥根茎，其化学成分主要含有蛋白质、多糖、氨基酸、尿囊素等［5-7］，具有补脾养胃、生津益肺、补肾涩精的功效［8］，以及抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、降血糖等［9-11］作用。赵国华等［12］从山药块茎中提取到一种山药多糖RDPS-I，阐明了其化学结构，并证明其具有免疫调节和抗肿瘤作用。郑晓珂等［13］采用小鼠子宫增重实验和人乳腺癌细胞（MCF-7） 增值实验对尿囊素雌激素样活性进行筛选，首次发现尿囊素具有雌激素样作用。陈艳等［14］用氨基酸分析仪测定了山药中各种氨基酸的组成，结果表明，怀山药中有17 种氨基酸，其中人体必需氨基酸的含有量占总氨基酸的25.32%。

本研究通过测定浸出物、尿囊素、腺苷、β-谷甾醇、氨基酸、山药多糖、单糖和寡糖等化学成分的含有量，对山药不同商品规格等级进行综合比较分析，为了更好的反映药材的质量与疗效的相关性，对山药抗氧化和降血糖等生物作用进行评价，以期为制定山药商品规格等级标准提供理论依据，对规范和保证山药的质量具有重要意义。

1 材料

1.1 样品 本实验采集河北安国、安徽亳州、四川荷花池、广西玉林、内蒙古赤峰等药材市场，河南焦作、河北安国等山药产地，以及焦作地区山药加工炮制企业的药材及饮片，共44 批，经河南中医药大学陈随清教授鉴定为薯蓣科植物薯蓣Dioscorea oppositaThunb.的干燥根茎。

山药在市场上依据加工方式的不同，主要有3 种商品规格，分别为毛山药、光山药、山药片，另有毛山药、光山药经炮制而成的饮片。

1.2 仪器 UV-2600 紫外分光光度计、LC-20A 高效液相色谱仪（日本岛津公司）；ME203E 分析天平（十万分之一，瑞士梅特勒-托利多公司）；BSA124S-CW 天平（万分之一，德国赛多利斯公司）；Milli-Q Academic A10 超纯水机（美国Millipore 公司）。

1.3 试药 尿囊素（批号B20909，纯度≥98%）、腺苷（批号B21356，纯度≥98%）、β-谷甾醇（批号B21972，纯度≥98%）、果糖（批号B21896，纯度≥99% ）、麦芽糖（批号B20834，纯度≥98%）、蔗糖（批号111507-200302，纯度≥99%） 对照品均购自上海源叶生物科技有限公司；葡萄糖 （批号110833-200503，纯度≥98%）、麦芽三糖（批号100274-200601，纯度100%） 对照品均购自中国食品药品检定研究院。1，1-二苯基-2-苦基肼（DPPH） 购自上海源叶生物科技有限公司；维生素E 软胶囊购自海南海神同洲制药有限公司；阿卡波糖购自德国拜耳医药保健有限公司；α-葡萄糖苷酶、4-硝基苯酚-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG） 购自美国Sigma 公司；α-淀粉酶、还原型谷胱甘肽（GSH） 购自北京索莱宝科技有限公司。乙腈、甲醇为色谱纯；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 等级划分 观察44 批山药药材及饮片性状，然后基于《七十六种药材商品规格标准》 与市售标示规格等级重新划分。毛山药按中部围粗6、4、2 cm 以上，划分为一等、二等、三等；光山药按直径1.8、1.5、0.8 cm以上，划分为一等、二等、三等；山药片按表面白色、黄白色、粉褐色，划分为一等、二等、三等。最终，得到61 个带编号样品。

编码原则如下，毛山药MXYYY，其中M 代表毛山药；X 代表等级编码，一等1，二等2，三等3；样品号YYY。光山药、毛山药片、光山药片编号分别为GXYYY、MPXYYY、GPXYYY，等级编码及样品号同毛山药。山药片PXYYY，其中P 代表山药片；X 代表等级编码，白色1，黄白色2，粉褐色3；样品号YYY。

2.2 水分、总灰分和二氧化硫残留量检查 参照2015 年版《中国药典》 山药项下测定，发现所有样品的水分、总灰分均符合规定，但二氧化硫残留量有8 份超标。

2.3 成分含有量测定

2.3.1 浸出物 参照2015 年版《中国药典》 山药项下测定，结果见表1。

2.3.2 尿囊素 参考文献［15］报道，将流动相调整为甲醇-水（2∶98）；体积流量0.5 mL／min；检测波长224 nm。色谱图见图1。

图1 尿囊素HPLC 色谱图

2.3.3 腺苷 参照2015 年版《中国药典》 中冬虫夏草腺苷［8］含有量测定方法，将流动相调整为甲醇-水（15∶85）；进样量20 μL。在此色谱条件下，样品中腺苷与其他组分获得了较好的分离，色谱图见图2。

2.3.4 β-谷甾醇 参考文献［16］报道，将流动相改为纯甲醇；检测波长205 nm；柱温35 ℃。色谱图见图3。

2.3.5 山药多糖 采用文献［17］报道的紫外分光光度法测定。

2.3.6 单糖、寡糖

图2 腺苷HPLC 色谱图

图3 β-谷甾醇HPLC 色谱图

2.3.6.1 对照品溶液制备 分别精密称取果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、麦芽三糖对照品10.05、21.21、10.00、12.09、12.35 mg 至2 mL 量瓶中，加水稀释至刻度，即得（含有量分别为5.025、10.605、5.00、6.045、6.175 g／L）。

2.3.6.2 供试品溶液制备 取山药粉末约1 g，精密称定，加15 mL 水煮沸15 min，冷却至60 ℃以下，加入5 mL 新鲜配制的2%淀粉酶溶液，55 ℃下保温1 h，不时振摇，加1 滴碘试液，应不显蓝色，若显蓝色则重复上述步骤直至不显色，冷却后移入50 mL 量瓶中，加水至刻度，混匀，滤过，续滤液用0.22 μm 微孔滤膜滤过，即得。

2.3.6.3 色谱条件 Inertsil NH2色谱柱 （4.6 mm ×250 mm，5 μm）；流动相乙腈-水（80∶20）；柱温30 ℃；体积流量1.0 mL／min；进样量20 μL。色谱图见图4。

图4 各成分HPLC 色谱图

2.3.7 方法学考察 尿囊素、腺苷、β-谷甾醇、山药多糖、果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、麦芽三糖在各自范围内线性关系良好（r＞0.999 8），加样回收率试验中RSD 分别为2.34%、1.38%、1.85%、2.60%、1.70%、1.83%、2.35%、2.37%、2.39%。

2.3.8 样品含有量测定 将61 批样品制成供试品溶液，在“2.3.6.3”项色谱条件下进样测定，计算含有量，结果见表1。

表1 山药样品浸出物及各成分含有量测定结果（%）

2.4 氨基酸含有量测定 采用氨基酸自动分析仪，由河南海瑞正检测有限公司进行测定。

2.5 体外抗氧化活性测定 参考文献［18］报道，取DPPH约40 mg，精密称定，溶于无水乙醇中制成20 mmol／mL溶液；取山药粉末5 g，加10 倍量75% 乙醇超声提取30 min，滤过，得供试品溶液，75% 乙醇依次稀释成0.1、1、5、10、20、30 g／L。取DPPH 溶液、供试品溶液各100 μL，充分混匀，室温下避光放置30 min，在517 nm 波长处测定吸光度Ai；取DPPH 溶液、75% 乙醇各100 μL，测定吸光度Ac；取供试品溶液、75%乙醇各100 μL，测定吸光度Aj，计算DPPH 清除率，公式为清除率＝ ［1-（Ai-Aj） ／Ac］×100%。

2.6 降血糖活性研究

2.6.1 供试品溶液制备 参考文献［19］报道，取山药粉末5 g，精密称定，加入40 mL 乙酸乙酯，超声30 min 提取2 次，滤过，合并滤液，挥干，残渣用无水乙醇溶解并定容至10 mL 量瓶中，依次稀释成0.5、0.25、0.125、0.08、0.062 5、0.045、0.031 25、0.015 6 g／mL，即得。

2.6.2 α-淀粉酶抑制活性测定 参照Sigma 公司α-淀粉酶操作说明书方法，取待测样品溶液0.5 mL，加入1%淀粉溶液0.5 mL，25 ℃水浴5 min，然后加入淀粉酶溶液0.5 mL，继续水浴3 min，加入1 mL DNS 溶液沸水浴中煮沸15 min 终止反应，流水冷却，加蒸馏水定容至25 mL，540 nm 下测定吸光度，计算酶活性抑制率。以样品质量浓度为横坐标（X），酶活性抑制率为纵坐标（Y） 绘制抑制曲线，求出IC50值。

酶活性抑制率＝ ［1-（A1-A2） ／ （A3-A4）］×100%，式中A1为待测溶液吸光度，A2为待测溶液本底吸光度，A3为空白对照溶液吸光度，A4为空白对照溶液本底吸光度。

2.6.3 α-葡萄糖苷酶抑制活性测定 参照α-葡萄糖苷酶操作说明书方法，在5 mL 67 mmol／mL、pH6.8 磷酸二氢钾缓冲液中加入0.1 mL 待测样品、0.1 mL GSH、0.1 mL α-葡萄糖苷酶、，摇匀后37 ℃温浴10 min，然后加入0.1 mL PNPG，37 ℃水浴反应20 min，加入0.1 mol／mL 碳酸钠溶液5 mL 终止反应，在400 nm 波长处测定吸光度。按“2.6.2”项下方法计算酶活性抑制率，求出IC50值。

3 数据分析

3.1 成分分析

3.1.1 聚类分析 采用SPSS 20.0 软件，以浸出物及9 种成分含有量为原始数据，将其标准化处理后进行聚类分析，结果见图5。

由此可知，相同规格不同等级山药片单独聚成一类，其他规格山药聚成一类，但各规格等级相互交叉较多，可见等级与成分含有量相关性不强，各等级之间无明显区别。

3.1.2 主成分分析 以浸出物及9 种成分含有量作为变量，特征值和累计贡献率作为判定依据，SPSS 20.0 软件对原始数据标准化处理后进行主成分分析。根据降维结果，选出2 个主成分PC1、PC2，特征值分别为8.286、1.054，累积贡献率达到93.397%，代表性强，浸出物、尿囊素、腺苷、果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖在PC1 上具有较高的载荷，说明PC1 主要反映了这些成分的信息。同理，PC2主要反映了β-谷甾醇、多糖、麦芽三糖的信息。

图5 15 批不同商品规格等级样品聚类树状图

以每个主成分对应的方差贡献率占所提取主成分总方差贡献率之和的比例作为权重，计算主成分综合得分（F），公式为F＝0.887 1F1＋0.112 8F2，结果见表2。

表2 不同规格等级样品成分含有量综合得分

由此可知，山药片排名第一，其次为毛山药、毛山药片、光山药、光山药片。但不同规格等级无显著规律性，表明等级划分与成分含有量无明显相关性。

3.1.3 方差分析 聚类分析和主成分分析结果表明，不同规格样品的等级划分与成分含有量相关性不强，故不再对其进行方差分析。采用SPSS 20.0 软件对不同商品规格样品进行方差分析，多重差异检验结果采用字母标记法表示，如在浸出物中山药片标示a，而其他商品规格不含a，即山药片与其他商品规格具有显著性差异；毛山药与光山药均含有b，故两者没有统计学差异。结果见图6。

图6 不同规格样品中各成分方差分析

由此可知，在浸出物、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、麦芽三糖、尿囊素、腺苷含有量方面，山药片与其他规格样品均有统计学差异，且含有量最高，其中麦芽三糖最低；在多糖含有量方面，光山药与其他规格样品均有统计学差异，含有量最高；在果糖含有量方面，5 种规格样品均具有统计学差异，其中山药片含有量最高；在谷甾醇含有量方面，5种规格样品均无统计学差异。

3.2 统计分析 本实验共测定了山药中17 种氨基酸，包括人体必需的7 种，其含有量以谷氨酸、精氨酸、天门冬氨酸最高，胱氨酸最低；必需氨基酸含有量依次为亮氨酸＞苯丙氨酸＞赖氨酸＞缬氨酸＞异亮氨酸＞苏氨酸＞蛋氨酸。SPSS 20.0 软件对17 种氨基酸含有量及总量在不同规格样品之间的差异进行方差分析，结果见表3。

表3 不同规格样品中氨基酸含有量方差分析（%，， n≥3）

表3 不同规格样品中氨基酸含有量方差分析（%，， n≥3）

注：在组间多重比较中，小写字母a～c 表示有显著差异（P＜0.05），大写字母A～C 表示有极显著差异（P＜0.01）。

由此可知，苏氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、组氨酸含有量在各规格样品之间无统计学差异；在谷氨酸、丝氨酸、精氨酸、丙氨酸含有量及总量方面，山药片与其他规格样品有统计学差异，含有量最高；在缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸含有量方面，毛山药与其他规格样品有统计学差异，含有量最高。

3.3 体外抗氧化活性 不同商品规格山药对DPPH 的清除作用见图7。由此可知，随着质量浓度升高，各商品规格山药的清除作用增强，其中山药片低于毛山药、光山药、毛山药片和光山药片。采用Logit 法计算IC50值，并用单因素方差分析比较不同商品规格样品的清除能力差异，发现山药片与其他规格样品有统计学差异，IC50为6.61 g／L，抗氧化活性最弱；毛山药、光山药、毛山药片、光山药片各等级之间的IC50均无统计学差异，分别为2.24、2.37、1.75、2.04 g／L。

图7 不同规格样品对DPPH 的清除作用

3.4 降血糖活性 不同规格样品对α-淀粉酶的抑制率均小于50%，远小于阳性对照阿卡波糖，即无明显抑制作用，与文献［19-20］报道一致，见图8。

图8 不同商品规格样品对α-葡萄糖苷酶的抑制作用

由此可知，随着质量浓度升高，各规格样品对α-葡萄糖苷酶的抑制作用增强，其中山药片高于毛山药、光山药、毛山药片和光山药片。采用Logit 法计算IC50值，发现各样品远大于阳性对照阿卡波糖，其中山药片抑制作用较强，IC50为0.034 8 g／L；光山药、光山药片的最大抑制率均未达到50%，无法计算IC50值；毛山药、毛山药片对α-葡萄糖苷酶的抑制作用最弱，IC50分别为0.099、0.103 7 g／L。

4 讨论与结论

鲜山药含水量高，农户会使用硫磺熏制和热风干燥的方法加工以达到干燥的效果［21］。由于加工技术水平有限、操作不规范等，有8 份样品二氧化硫残留量超标。本实验以水溶性浸出物含有量为指标对样品进行测定，结果表明有6 份不合格，推测在产地加工时毛山药有一个滨水的过程，水溶性成分会有一定流失。

山药化学成分复杂，以淀粉为主，目前有效成分和指标物质不明确。本研究通过测定浸出物、氨基酸及9 种成分的含有量，发现各规格之间有差异，其中山药片大部分高于其他规格，但各等级之间无显著性差异。山药片降血糖活性强于其他规格，但是抗氧化活性更低；山药片大部分成分含有量均高于其他规格，与其降血糖活性呈正相关；山药片中多糖、麦芽三糖含有量较低，文献报道多糖为山药主要活性成分，具有较强的抗氧化活性［22］，因此各成分含有量与抗氧化活性呈负相关可能与其含有量有较大联系。

各规格样品之间成分含有量差异明显，可能与加工方式有关。山药加工成商品需要经过去皮、滨水、晾晒等诸多步骤，而且不同规格加工方式也不一样。毛山药、光山药有时会硫熏，这在一定程度上会影响成分含有量，并且光山药还要进行搓圆、打光等步骤，更容易流失；山药片基本上都是直接切片、烘干，可有效保存成分，所以总量较高。

同时，毛山药、光山药、毛山药片、光山药片抗氧化活性较强，可能是这些样品在加工过程中经过了硫熏，残留有亚硫酸基团，它具有清除自由基的能力。但有些毛山药、光山药（包括饮片） 并未检测到二氧化硫残留，其抗氧化活性也较强，并且其残留量是否超标与抗氧化活性及多糖含有量均无明显相关性，具体原因有待进一步研究。