石吊兰HPLC 指纹图谱的建立

员 浬，陈小秀，徐文芬，刘 趣，刘 娇，马敏龙，刘恩稳

（贵州中医药大学，贵州贵阳 550025）

石吊兰为苦苣苔科吊石苣苔属植物吊石苣苔Lysionotus pauciflorusMaxim.的干燥地上部分，广泛分布于贵州、安徽、广西等中国南部地区及台湾地区，生于海拔300～2 000 m的丘陵、山地林中树上或岩石上［1-2］，其性温，味苦，归肺经，具有化痰止咳、软坚散结的功效，常用于咳嗽痰多、瘰疠痰核等症［3］。现代研究表明，石吊兰主要含有黄酮类、挥发油类、苯乙醇苷类、菖蒲烷类等成分［4-8］，具有明显的抗结核菌、降压、抗氧化、止咳化痰、抗粥样动脉硬化、免疫调节作用［9-14］，已作为益肺止咳胶囊原料药材，对慢性支气管炎引起的咳嗽咯痰及肺结核、淋巴结核等疾病疗效显著，临床应用广泛［15-17］。目前，石吊兰虽已收载于2015 年版《中国药典》，但在常规检查的基础上仅建立了以石吊兰素为指标的含有量测定方法，这与中药多成分、多靶点的特点，以及其市场需求量大这一现状不匹配，同时该药材多为野生资源，质量参差不齐，故全面评价其质量很有必要。

中药指纹图谱具有特征性、整体性、模糊性等特点，可充分反映出中药复杂体系中各成分的整体状况，是目前其质量控制较有效的手段之一，但目前对于石吊兰的指纹图谱仅见谭家华等［18］初步报道。本研究建立21 批石吊兰的HPLC 指纹图谱，运用聚类分析、主成分分析进行系统评价，以期为该药材质量控制提供参考依据。

1 材料

1.1 仪器 Thermo Ulti Mate 3000 高效液相色谱仪（美国赛默飞世尔科技公司）；SK5200H 超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）；AG135 天平（十万分之一，瑞士Mettler-Toledo 公司）；HH-S2 数显恒温水浴锅（常州普天仪器制造有限公司）。

1.2 试药 乙腈 （色谱纯，国药集团化学试剂有限公司）；甲醇（色谱纯，国药集团化学试剂有限公司；分析纯，天津市富宇精细化工有限公司）；磷酸（优级纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）。石吊兰素对照品（中国食品药品检定研究院，111555-200602，纯度98.10%）；采于贵州省各分布区，经贵州中医药大学孙庆文教授鉴定为苦苣苔科吊石苣苔属植物吊石苣苔Lysionotus pauciflorusMaxim，具体见表1。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Thermo Hypersil GOLD-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相乙腈（A） -0.1%磷酸（B），梯度洗脱（0～6 min，13%～18%A；6～10 min，18%～20%A；10～26 min，20%～100%A）；检测波长334 nm；柱温35 ℃；体积流量1 mL／min；进样量10 μL。

2.2 对照品溶液制备 取石吊兰素对照品0.10 mg，精密称定，置于10 mL 量瓶中，85% 甲醇溶解稀释至刻度，0.45 μm微孔滤膜过滤，即得（0.010 00 mg／mL）。

2.3 供试品溶液制备 取各批药材粉末约0.5 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加入85%甲醇25 mL，超声提取20 min，放冷至室温，过滤，药渣提取2 次，合并滤液，挥干，85%甲醇复溶并定容于25 mL量瓶中，0.45 μm 微孔滤膜过滤，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 专属性试验 精密吸取对照品、供试品、空白溶液，在“2.1”项色谱条件下测定，发现空白溶液在相应位置处未见色谱峰，供试品溶液色谱图中石吊兰素色谱峰的保留时间与对照品溶液一致。将药材和对照品UV 光谱图进行比对，见图1，可知其峰纯度较高，纯度因子为1 000，分离度大于1.5，方法专属性良好。

表1 样品信息

图1 各样品UV 光谱图

2.4.2 精密度试验 取 “2.3”项下供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下连续进样6 次，以石吊兰素为参照峰，测得其余各共有峰相对保留时间RSD 为0.070%～1.7%，相对峰面积RSD 为0.95～2.2%，表明仪器精密度良好。

2.4.3 稳定性试验 取同一供试品溶液，于0、2、4、8、12、14、24 h 在“2.1”项色谱条件下进样，以石吊兰素为参照峰，测得其余各共有峰相对保留时间RSD 为0.079%～1.1%，相对峰面积RSD 为0.40%～2.3%，表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.4.4 重复性试验 取同一批药材，按“2.3”项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样，以石吊兰素为参照峰，测得其余各共有峰相对保留时间RSD 为0.054%～1.9%，相对峰面积RSD 为0.93%～2.9%，表明该方法重复性良好。

2.5 HPLC 指纹图谱建立 取21 批样品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样，建立指纹图谱，见图2。由此可知，21 批样品中标定12 个共有峰，12 号色谱峰的保留时间与对照指纹图谱一致（图3），而且其峰形及分离度较好，基线稳定，故作为参照峰计算相对保留时间、峰面积，见表2～3。

图2 21 批样品HPLC 指纹图谱

图3 药材HPLC 对照图谱

将21 批样品HPLC 指纹图谱导入相似度软件，以S2 为参照图谱，采用多点校正及自动匹配，时间窗宽度设为0.5，中位数法生成对照图谱 （图2），计算相似度，见表4。

由此可知，21 批样品相似度为0.100～0.980，差异较大；S20 （安徽黄山）、S21 （安徽黄山） 相似度低，均小于0.600，可能与其气候、土壤、地理环境等条件有关；S2 （贵州凯里） 为参考，S3 （贵州册亨）、S4 （贵州册亨）、S5 （贵州册亨）、S6 （贵州安龙）、S7 （贵州安龙）、S8 （贵州安龙）、S9 （贵州兴义）、S10 （贵州册亨）、S11（贵州安龙）、S12 （贵州安龙） 药材相似度均大于0.800，而S14 （贵州独山）、S15 （贵州独山）、S16 （贵州独山）、S18 （贵州三都）、S19 （贵州三都） 药材的相似度均小于0.800，即产地为黔西南布依族苗族自治州内的药材相似度较高，而产地为黔南布依族苗族自治州的较低。结合表2～3，可知不同产地药材成分类型较一致，但其含有量相差较大。

表2 21 批样品共有峰相对保留时间

表3 21 批样品共有峰相对峰面积

表4 21 批样品相似度

2.6 聚类分析 采用SPSS 18.0 软件对21 批样品的量化峰面积进行系统聚类，采用组间距离法结合欧氏平方距离进行分析，树状图见图4。由此可知，当欧氏平方距离为25 时，21 批样品可分为2 类，S1、S20、S21 聚为1 类，其他批次聚成1 类；当欧氏平方距离为20 时，其可分为4类，S1 为1 类，S20 和S21 聚成1 类，S2、S13、S4、S11、S7 聚为1 类，其余批次聚为1 类；当欧氏平方距离为15时，其可分为6 类，S1 为1 类，S2 为1 类，S13 为1 类，S20、S21 聚为1 类，S4、S7、S11 聚为1 类，其余聚为1类。取欧氏平方距离为20，可知产地为安徽省的2 批药材聚为1 类，为黔南布依族苗族自治州的聚为1 类，为贵州遵义的单独聚为1 类。S20、S21 与其他产地药材存在一定差异，其2、3 号峰的相对峰面积明显大于其他批次，可能是与其他批次样品被聚为2 类的原因。

2.7 主成分分析 采用SPSS 18.0 软件，导入21 批样品12 个共有峰的量化峰面积，以主成分的特征值及贡献率为参考依据进行主成分因子分析，计算累积方差贡献率及综合得分，得到总方差解释变异量，见表5。采用正交性旋转法，得到12 个共有峰在5 个主成分中的旋转矩阵，见表6。

图4 21 批样品聚类分析树状图

表5 主成分特征值及方差

表6 各主成分矩阵

根据表6，以Z1、Z2、Z3、Z4、Z5分别代表主成分1、2、3、4、5，Z代表5 个主成分综合值，X1～X12分别代表12 个共有峰峰面积的标准化数值，用于反映21 批样品所表征的信息，得到线性组合表达式分别为Z1＝0.275X1＋0.180X2＋0.659X3＋0.772X4＋0.715X5＋0.751X6＋0.148X7＋0.516X8＋0.691X9＋0.374X10＋0.220X11-0.569X12、Z2＝0.120X1-0.730X2-0.524X3＋0.253X4＋0.405X5＋0.141X6＋0.466X7-0.685X8＋0.070X9＋0.672X10＋0.631X11＋0.527X12、Z3＝0.065X1＋0.569X2＋0.147X3-0.326X4＋0.197X5-0.409X6-0.091X7＋0.089X8-0.440X9＋0.527X10＋0.695X11-0.215X12、Z4＝-0.418X1＋0.190X2-0.044X3-0.152X4-0.227X5-0.171X6＋0.715X7＋0.340X8＋0.399X9＋0.106X10＋0.057X11＋0.161X12、Z5＝0.792X1＋0.170X2＋0.115X3-0.320X4-0.289X5＋0.100X6＋0.035X7-0.004X8＋0.295X9＋0.135X10-0.053X11＋0.336X12。

将上述所得表达式加合，构建综合评价函数，得到21批样品的综合得分，将其进行排序，结果见表7。

Z＝0.833X1＋0.379X2＋0.353X3＋0.227X4＋0.801X5＋0.412X6＋1.274X7＋0.255X8＋1.015X9＋1.813X10＋1.550X11＋0.240X12。Z值越大，表明药材的综合质量越高。

表7 各样品主成分得分及排序

不同样品综合得分依次为S2＞S4＞S15＞S6＞S10＞S13＞S7＞S11＞S5＞S20＞S1＞S16＞S18＞S14＞S21＞S8＞S9＞S3＞S17＞S19＞S12，在排名前10 的药材中，产地为黔西南布依族苗族自治州的占60%，为贵州省黔南布依族苗族自治州的占20%，为贵州省黔东南苗族侗族自治州的占10%，为安徽省黄山的占10%。

以主成分1、2、3 的得分值建立其三维坐标体系的散点图，见图5。由此可知，S1 距离较远，聚为一类；S20与S21 距离较近，聚为一类；S2、S4、S7、S11、S13 距离较近，聚为一类；其余样品聚为一类，结果与聚类分析、相似度评价一致。

3 讨论

图5 21 批样品三维散点图

本实验对Thermo Hyperil GOLD-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Thermo Accucore-C18（150 mm×4.6 mm，2.6 μm）色谱柱进行考察，发现前者分离效果优于后者；对流动相（甲醇-水、甲醇-0.1% 磷酸、乙腈-0.1% 磷酸） 及柱温（25、30、35 ℃） 进行考察，发现流动相为乙腈-0.1% 磷酸、柱温为35 ℃时，色谱峰分离效果较佳。此外，对提取方法（超声、回流）、提取溶剂（甲醇、乙醇） 及其体积分数 （55%、65%、75%、85%、95%、100%）、料液比（1∶30、1∶50、1∶70、1∶90、1∶110）、提取时间（10、20、30、40、50、60 min）、提取次数进行考察。最终，确定85%甲醇超声提取3 次，每次20 min 作为最优提取条件。

S20、S21 与其余分布区的石吊兰相似度低，即安徽省产的这2 批药材与贵州省具有一定差异；在贵州省内，大部分黔南分布区产的药材与其他产区相似度低。聚类分析将安徽省产的2 批药材聚为1 类，贵州省内分布区产的聚为1 类，可能是由于地理环境、气候的差异所致；贵州省遵义地区产的药材被单独分为1 类，可能是由于采收时间靠前、分布地区较其余批次远、年均气温低于大部分地区等原因所致。

综上所述，本研究建立了石吊兰HPLC 指纹图谱，并结合聚类分析、主成分分析对该药材的质量进行综合评价，可为其品种鉴别、种质筛选提供参考。