巴特日-7 对肠炎大鼠及其血清TNF-α、IL-1β、IL-10 水平的影响

李淑艳，乌云参丹，刘 燕，白玉霞，李淑红，王玉华

（1.内蒙古民族大学蒙医药学院，内蒙古通辽 028000； 2.内蒙古民族大学护理学院，内蒙古通辽 028000； 3.内蒙古医科大学药学院，内蒙古呼和浩特 010110）

巴特日-7 为蒙医临床常用的治疗肠炎药物，是由草乌叶、诃子、多叶棘豆、茜草、黑云香、银朱、麝香7 味药材组成的水丸制剂，具有杀粘、清热解毒的功效，对瘟疫、麻疹、痘疹、肠痛、胸痛、白喉塞等疾病具有治疗作用［1］，被《部颁标准·蒙药分册》［2］收载，前期研究［3］表明其有效部位是乙酸乙酯、正丁醇部位。肠炎是由病毒、细菌、真菌和寄生虫等引起的肠道疾病［4］，发病机制可分为急性、慢性。建立肠炎模型的方法以药物型为主［5］，操作方法简便。本研究以巴特日-7 有效部位为对象，采用5%葡聚糖硫酸钠建立肠炎模型大鼠，对该方抑制肠炎的作用进行了研究。

1 材料

1.1 动物 清洁级SD 大鼠，雄雌各半，体质量180～200 g，购自辽宁长生生物技术有限公司，生产许可证号SCXK （辽） 2015-（0001）。

1.2 试剂与药物 草乌叶、多叶棘豆，采自内蒙古扎鲁特旗自然保护区罕山，茜草、诃子、麝香、黑云香、银朱购自内蒙古通辽市泽强药业，经内蒙古民族大学布和巴特尔教授鉴定为正品。柳氮磺吡啶肠溶片（批号201606020，上海福达制药有限公司）。葡聚糖硫酸钠（Dextran sulfate sodium，DSS，批号0216011080，北京毕特博生物技术有限公司）；大便隐血检测试纸条（批号2400458，上海源叶生物有限公司）；TNF-α ELISA 试剂盒（批号E20170501A）、IL-1β ELISA 试剂盒 （批号E20170401A）、IL-10 ELISA 试剂盒 （批号E20170401A） 均购自上海源叶生物有限公司。

1.3 仪器 旋转蒸发仪（N-1300，上海爱朗仪器有限公司）；电子天平（AUY120D，日本岛津公司）；CO2培养箱（LabServ CO150，美国Thermo公司）；Sunrise 酶标仪［帝肯（上海） 贸易有限公司］；倒置生物显微镜（日本Nikon 公司）；Histocentre3 包埋机（美国Thermo 公司）。

2 方法

2.1 巴特日-7 不同提取部位的制备 按处方比例（草乌叶250 g、诃子250 g、茜草100 g、多叶棘豆100 g、黑云香100 g、银朱50 g、麝香0.5 g） 称取各单味药材共7.5 kg，加入10 倍量95%乙醇回流提取3 次，每次4 h，合并提取液，减压浓缩挥去溶剂，得到乙醇提取物，冷冻干燥挥去溶剂，用水悬浮后分别用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，依次得到514.51 g 石油醚部位、372.01 g氯仿部位、602.25 g 乙酸乙酯部位、213.75 g 正丁醇部位、108.11 g 水残余部位，提取率分别为6.86%、4.96%、8.03%、2.85%、1.44%。取上述乙酸乙酯、正丁醇部位（比例为1∶1） 的干浸膏适量，加水配制成0.296 g 生药／mL。

按照处方比例称取药材共0.93 kg，加入10 倍量水煎煮1.5 h，药渣加入8 倍量水煎煮1 h 后再加入6 倍量水煎煮0.5 h，合并滤液后浓缩，得到522.6 g 水提物，提取率为56.2%，加水配制成0.296 g 生药／mL。

2.2 分组、造模及给药 90 只雄性SD 大鼠随机分为正常对照组（生理盐水），模型组（5% DSS，1.0 g／kg），阳性对照组 （柳氮磺吡啶肠溶片，0.5 g／kg），巴特日-7 水提物低、中、高剂量组（0.45、0.90、1.80 g／kg） 及巴特日-7 有效部位低、中、高剂量组（0.45、0.90、1.80 g／kg），每组10 只，灌胃剂量20 mL／kg。除正常组外其余各组大鼠灌胃5% DSS 溶液（1.0 g／kg）建立肠炎模型，每天1 次，连续7 d，第4 天开始灌胃给药，每天1 次，连续7 d。

2.3 大鼠一般状态评价 对大鼠精神状态及活动状况、皮毛光滑度、肛周大便污染等进行观察，造模后每天上午9：00 给予饲料（50 g／只），第2 天上午9：00 称定剩余的饲料质量及大鼠体质量。计算24 h 内各组大鼠的平均摄食量，公式为平均摄食量＝ （饲料总质量-饲料剩余质量） ／大鼠体质量。

2.4 疾病活动指数评分（disease activity index，DAI） 计算 给药第4、7 天将各组大鼠置于单笼中，大便隐血检测试剂条检测便血情况［6］，并观察2 h 内排便情况，疾病活动指数评分＝ （体质量下降分数＋便血分数＋大便性状分数） ／3。结果见表1。

2.5 大鼠结肠水肿程度评价 将各组大鼠处死后取结肠1 cm，滤纸将血液及表面水分吸干，电子天平称定湿质量，再于60 ℃烘箱中烘烤24 h，称定干质量，计算结肠湿／干质量比［7］。

表1 DAI 评分Tab.1 DAI scores

2.6 ELISA 检测血清TNF-α、IL-1β、IL-10 水平 给药第1、4、7 天从大鼠尾静脉采血各0.5 mL，低温3 500 r／min 离心20 min，分离血清，-20 ℃保存，对TNF-ɑ、IL-1β、IL-6、IL-10 水平进行检测，操作按照试剂盒说明进行。

2.7 HE 染色观察结肠组织病理学状态 末次给药后大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，开腹取距离肛门6～8 cm 处结肠肠管1 cm，10%福尔马林固定24 h，梯度酒精脱水，石蜡包埋，切成4 mm 厚度薄片，HE 染色，于显微镜下观察其组织形态学的变化。

2.8 统计学分析 采用SPSS 19.0 软件进行分析，数据以（） 表示，多组间比较采用单因素方差分析。以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 巴特日-7 对肠炎模型大鼠体质量及摄食量的影响 正常对照组大鼠活动敏捷，体质量正常增加，皮毛光滑，无腹泻，大便呈颗粒状；模型组大鼠逐渐出现厌食，皮毛无光泽，体质量减轻，肛周污染，可见稀便、粪便隐血为阳性；给药组大鼠摄食量、体质量均有不同程度的增加，稀便、血便也有不同程度的减轻。如表2～3 所示，给药第3、6天巴特日-7 水提物、有效部位高剂量组体质量较模型组增加（P＜0.05，P＜0.01）；第3、6 天巴特日-7 水提物、有效部位中、高剂量组24 h 摄食量较模型组增加（P＜0.05，P＜0.01）；水提物与有效部位体质量、摄食量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2 巴特日-7 对肠炎模型大鼠体质量的影响（， n＝10）Tab.2 Effects of Bateri-7 on the body mass of enteritis model rats （， n＝10）

表2 巴特日-7 对肠炎模型大鼠体质量的影响（， n＝10）Tab.2 Effects of Bateri-7 on the body mass of enteritis model rats （， n＝10）

注：与正常对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

表3 巴特日-7 对肠炎模型大鼠摄食量的影响（， n＝10）Tab.3 Effects of Bateri-7 on food intake of enteritis model rats （， n＝10）

表3 巴特日-7 对肠炎模型大鼠摄食量的影响（， n＝10）Tab.3 Effects of Bateri-7 on food intake of enteritis model rats （， n＝10）

注：与正常对照组比较，**P＜0.01；与模型组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

3.2 巴特日-7 对肠炎模型大鼠DAI 的影响 如表4 所示，与正常对照组比较，模型组大鼠DAI 升高（P＜0.05，P＜0.01）；给药第3、6 天，巴特日-7水提物、有效部位高剂量组DAI 较模型组降低（P＜0.05，P＜0.01）；水提物与有效部位DAI 比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

表4 巴特日-7 对肠炎模型大鼠DAI 的影响（， n＝10）Tab.4 Effects of Bateri-7 on DAI of enteritis model rats （， n＝10）

表4 巴特日-7 对肠炎模型大鼠DAI 的影响（， n＝10）Tab.4 Effects of Bateri-7 on DAI of enteritis model rats （， n＝10）

注：与正常对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

3.3 巴特日-7 对肠炎模型大鼠结肠水肿的影响如表5 所示，给药7 d 后，巴特日-7 水提物、有效部位中、高剂量组结肠湿／干质量比较模型组降低（P＜0.05，P＜0.01）。

表5 巴特日-7 对肠炎模型大鼠结肠水肿的影响（，n＝10）Tab.5 Effects of Bateri-7 on colon edema of enteritis model rats （， n＝10）

表5 巴特日-7 对肠炎模型大鼠结肠水肿的影响（，n＝10）Tab.5 Effects of Bateri-7 on colon edema of enteritis model rats （， n＝10）

注：与正常对照组比较，**P＜0.01；与模型组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

3.4 巴特日-7 对肠炎模型大鼠TNF-α、IL-1β、IL-10 水平的影响 如表6～8 所示，给药7 d 后与模型组比较，巴特日-7 水提物、有效部位中、高剂量组TNF-ɑ、IL-1β 水平降低，IL-10 水平增加（P＜0.05，P＜0.01）；水提物与有效部位以上指标比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

3.5 巴特日-7 对肠炎模型大鼠结肠组织病理学的影响 如图1 所示，正常对照组大鼠结肠黏膜结构清晰，无水肿，上皮组织完好无损坏，未见炎症细胞的聚集和浸润；模型组大鼠结肠水肿明显增加，上皮结构消失，腺体破坏，炎症细胞的浸润增加；巴特日-7 水提物、有效部位中、高剂量组大鼠结肠组织炎症细胞的浸润明显减少，水肿减轻，上皮结构较完整；巴特日-7 水提物、有效部位低剂量组大鼠上述情况有轻微的好转，但炎症细胞较多，有大量的出血点。

表6 巴特日-7 对肠炎模型大鼠TNF-α 水平的影响（， n＝10）Tab.6 Effects of Bateri-7 on TNF-α level of enteritis model rats （， n＝10）

表6 巴特日-7 对肠炎模型大鼠TNF-α 水平的影响（， n＝10）Tab.6 Effects of Bateri-7 on TNF-α level of enteritis model rats （， n＝10）

注：与正常对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

表7 巴特日-7 对肠炎模型大鼠IL-1β 水平的影响（， n＝10）Tab.7 Effects of Bateri-7 on IL-1β level of enteritis model rats （， n＝10）

表7 巴特日-7 对肠炎模型大鼠IL-1β 水平的影响（， n＝10）Tab.7 Effects of Bateri-7 on IL-1β level of enteritis model rats （， n＝10）

注：与正常对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

表8 巴特日-7 对肠炎模型大鼠IL-10 水平的影响（， n＝10）Tab.8 Effect of Bateri-7 on IL-10 level of enteritis model rats （， n＝10）

表8 巴特日-7 对肠炎模型大鼠IL-10 水平的影响（， n＝10）Tab.8 Effect of Bateri-7 on IL-10 level of enteritis model rats （， n＝10）

注：与正常对照组比较，**P＜0.01；与模型组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

图1 HE 染色观察各组结肠组织病理学状态（×100）Fig.1 Observation on the histopathological status of colon in each group by HE staining （× 100）

4 讨论

巴特日-7 在蒙医临床上使用的剂型是水丸制剂［1］。本研究采用急性炎症动物模型，对巴特日-7水提物、有效部位（乙酸乙酯、正丁醇部位） 的抗炎作用进行了探讨。

葡聚糖硫酸钠是一种硫酸化多糖类物质，在结肠段局部可通过肠黏膜化学损伤而引发肠炎［8］，主要评价指标是大鼠体质量、24 h 摄食量、疾病活动指数、结肠湿／干质量比、血清炎性细胞因子等。本实验发现，造模7 d后与正常对照组比较，模型组大鼠体质量及24 h摄食量均下降，疾病活动指数、结肠湿／干质量比增加，表明造模成功；灌胃DSS 与自由饮水相比，前者可控制大鼠给药量、给药时间等参数，并避免大鼠药物吸收量不同引起的实验误差。

巴特日-7 是蒙医临床用于治疗肠炎的常用经典复方，相关研究报道已证实该方治疗肠炎的作用［9-15］。本实验结果表明，巴特日-7 水提物、有效部位对DSS 致肠炎模型大鼠均表现出基本相同的作用，其体质量、24 h 摄食量、疾病活动指数、结肠湿／干重量比均有显著改善；HE 染色显示，巴特日-7 水提物、有效部位低、中、高剂量组结肠黏膜上皮组织完整，炎症细胞的浸润明显减少，水肿和充血明显减轻，说明其对肠黏膜损伤均有修复作用；与模型组比较，巴特日-7 水提物、有效部位中、高剂量组疾病活动指数有所降低，血清TNF-ɑ、IL-1β水平降低，IL-10 水平增加，具有一定的抑制肠炎作用。

巴特日-7 具有杀粘、清热解毒功效，蒙医临床上将其用于主治瘟疫、肠刺痛等疾病是具有一定科学依据的［2］。该方主要含有生物碱［16］、有机酸［17］、黄酮［18］，目前课题组已从其有效部位中分离得到没食子酸、鞣花酸［19］、苯甲酸、芦丁、β-谷甾醇、槲皮素等成分，可能是抗炎的主要物质，具体有待进一步研究。