基于特征图谱和一测多评法的醋五味子质量控制

刘小康，王玥玥，赫一鸣，王康宇，贡济宇

（长春中医药大学药学院，吉林长春 130117）

中药作为一个复杂体系包含多种成分，目前我国现有的质量标准主要是通过性状鉴别、显微鉴别和理化鉴别来确定真伪，并以药物中几种成分为指标来进行含有量测定，不能反映其整体特征［1］。2015 年版《中国药典》 一部重点加强中药质量的整体控制，完善中药复杂体系质量标准研究的思路、方法和模式，特别是中药材标准中首次收入特征图谱，使其质量可控性增强［2］。一测多评法是近年来解决中药多指标分析时对照品短缺问题的可行出路之一，例如邹献亮等［3］同时测定熟地黄中4种苯乙醇苷，蔡楚兰等［4］同时测定参芪二仙片中9种成分，王鹏飞等［5］对蟾酥进行质量控制。

醋五味子为木兰科植物五味子Schisandra chinensis（Turcz.） Baill.的干燥成熟果实，秋季成熟时采摘，晒干或蒸后晒干，除去果梗和杂质，加食醋蒸后晒干，即得［6］。本实验建立醋五味子特征图谱，结合木脂素类成分定量分析，增加了其质量整体可控性，也体现了现代分析技术在建立符合中医药特点质量标准体系方面的新进展，可促进相关药效物质基础和作用机制的研究。

不同产地、炮制工艺等都可能造成市场上醋五味子饮片的质量参差不齐，但2015 年版《中国药典》 中其含有量测定项下未规定指标限量，缺少确切的质量控制方法。本研究收集不同批次市售醋五味子饮片48 批，建立了HPLC 特征图谱，采用一测多评法测定4 种木脂素含有量，以期全面反映该类成分相关信息，为炮制品质量评价提供参考。

1 材料

LC-2030 型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；Waters Alliance 高效液相色谱仪（美国Waters 公司）；Agilent 1260 Infinity 高效液相色谱仪（美国Agilent 公司）；AB135-S 型电子分析天平（十万分之一，瑞士梅特勒-托利多公司）。五味子醇乙对照品（批号wkq18020804，纯度≥98%，四川维克奇科技生物有限公司）；五味子醇甲 （批号110857-201815，纯度≥98%）、五味子甲素（批号110764-201714，纯度≥98%）、五味子乙素（批号110765-201512，纯度≥98%） 对照品均购于中国食品药品检定研究院。乙腈 （色谱级，美国Thermo Fisher Scientific 公司）；其他试剂均为分析纯；水为屈臣氏蒸馏水。

本研究收集了不同市售醋五味子饮片共48 批，具体见表1。

表1 样品信息Tab.1 Information of samples

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Hypersil C18色谱柱 （250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温35 ℃；流动相乙腈（A） -水（B），梯度洗脱 （0～5 min，0～55% A；5～35 min，55%～85% A；35～40 min，85%～55% A；40～45 min，55% A～0）；检测波长254 nm；体积流量1.0 mL／min；进样量10 μL。理论塔板数按五味子醇甲计，应不低于2 000。色谱图见图1。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.2 对照品溶液制备 精密称取各对照品适量，置于10 mL 量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，制成分别含五味子醇甲0.328 mg／mL、五味子醇乙0.156 mg／mL、五味子甲素0.231 mg／mL、五味子乙素0.188 mg／mL，即得。

2.3 供试品溶液制备 称取样品（S1～S48） 粉末（过3 号筛） 各0.25 g，精密称定，置于20 mL 量瓶中，加入20 mL 甲醇，称定质量，超声（250 W，20 kHz） 处理20 min，甲醇补充减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 醋五味子HPLC 特征图谱［7-10］

2.4.1 特征图谱建立 取样品（S1～S48） 粉末，精密称定，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，精密吸取10 μL，在“2.1”项条件下测定，记录45 min 色谱图。采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2012.1 版） 进行评价，设置S1 样品图谱为参照图谱生成特征图谱，共16 个特征峰，其中峰1 为五味子醇甲，峰4 为五味子醇乙，峰11为五味子甲素，峰14 为五味子乙素。见图2。

2.4.2 精密度试验 精密吸取供试品溶液（S32），在“2.1”项条件下连续测定6 次，测得各特征峰与内标峰（五味子醇甲） 比值的相对保留时间、相对峰面积RSD 均小于2.0%，表明仪器精密度良好。

图2 醋五味子HPLC 特征图谱（254 nm）Fig.2 HPLC characteristic chromatogram of S.chinensis processing with vinegar （254 nm）

2.4.3 稳定性试验 精密吸取供试品溶液（S32），室温下于0、2、4、6、12、24 h 在“2.1”项条件下测定，测得各特征峰与内标峰（五味子醇甲） 比值的相对保留时间、相对峰面积RSD 均小于2.0%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.4.4 重复性试验 取供试品（S32） 粉末6 份，精密称定，制备供试品溶液，在“2.1”项条件下测定，测得特征峰与内标峰（五味子醇甲） 比值的相对保留时间、相对峰面积RSD 均小于2.0%，表明该方法重复性良好。

2.5 4 种木脂素类成分含有量测定［10-18］

2.5.1 线性关系考察 精密吸取对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL，置于1 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，在“2.1”项条件下测定。以峰面积为纵坐标（Y），溶液质量浓度为横坐标（X） 进行回归，结果见表2，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表2 各成分线性关系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.5.2 精密度试验 精密吸取供试品溶液（S32），在“2.1”项条件下连续测定6 次，测得各成分峰面积RSD 均小于1.5%，表明仪器精密度良好。

2.5.3 重复性试验 精密吸取供试品溶液（S32），在“2.1”项条件下测定，测得各成分峰面积RSD均小于2.5%，表明该方法重复性良好。

2.5.4 稳定性试验 精密吸取供试品溶液（S32），室温下于 0、2、4、8、10、12、16、24 h 在“2.1”项条件下测定6 次，测得各成分峰面积RSD 均小于3.0%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.5.5 加样回收率试验 取含有量已知的样品（S32） 粉末约0.125 g，精密称定，共9 份，以80%、100%、120%水平分别精密加入对照品溶液适量，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项条件下测定，测得五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素平均加样回收率分别为97.35%、99.91%、101.05%、99.57%，RSD分别为1.54%、1.51%、1.35%、1.88%。

2.6 相对校正因子计算 精密吸取对照品溶液10 μL，在“2.1”项条件下测定。以五味子醇甲为内标，计算其他3 种成分的相对校正因子，见表3。

表3 各成分相对校正因子（五味子醇甲为内标， n＝2）Tab.3 Relative correction factors of various constituents （schisandrin as an internal standard， n＝2）

2.7 耐用性考察 精密吸取对照品溶液，在不同仪器和色谱柱上各进样10 μL测定，平行2 次，计算相对校正因子。结果，3 种成分相对校正因子的RSD 均小于2.0%，见表4。

表4 不同仪器、色谱柱上相对校正因子（n＝2）Tab.4 Relative correction factors on different instruments and columns （n＝2）

2.8 色谱峰定位 精密吸取对照品溶液，在不同仪器、色谱柱上各进样10 μL 测定。以五味子醇甲为内标，计算其他3 种成分的相对保留时间，结果见表5。

表5 不同仪器、色谱柱上相对保留时间（n＝2）Tab.5 Relative retention time on different instruments and columns （n＝2）

2.9 样品含有量测定 取48 批样品制备供试品溶液，在“2.1”项条件下进样10 μL 测定，分别采用一测多评法、外标法计算含有量。结果，2 种方法所得结果无显著性差异（RSD＜5.0%），见表6。

3 讨论

3.1 色谱条件选择 本实验比较了甲醇、乙腈等不同比例的流动相系统及不同类型的色谱柱，最终选用乙腈-水与Hypersil C18色谱柱 （250 mm ×4.6 mm，5 μm），各成分色谱峰分离度良好。为了使各成分均有较好响应，本实验比较了不同检测波长（220、254 nm），发现在254 nm 下色谱峰峰形较好，并且均有吸收，分离度理想。

表6 各成分含有量测定结果（%， n＝2）Tab.6 Results of content determination of various constituents （%， n＝2）

3.2 相似度分析 在各批醋五味子HPLC 特征图谱中，五味子醇甲色谱峰分离度良好，峰面积较大，所以确定其作为参照峰。对48 批样品的图谱进行相似度评价，确认了16 个共有峰，相似度大于0.90；不同批样品所含成分大致相同，但部分相似度较低，可能在含有量上有所差异，见表7。

表7 48 批样品相似度Tab.7 Similarities of forty-eight batches of samples

3.3 相对校正因子耐用性 本实验考察了不同仪器、色谱柱、柱温（30、35、40 ℃）、体积流量（0.6、0.8、1.0、1.2 mL／min），发现它们对相对校正因子均无显著影响，具有良好的耐用性。

3.4 结果分析 图3、表6 显示，不同市售醋五味子饮片中总木脂素含有量差异较大，可能与产地有关；不同产地五味子中各成分含有量不同，其炮制品中亦然，提示建立相关炮制规范的重要性。

图3 48 批样品含有量对比Fig.3 Content comparison of forty-eight batches of samples

定性的特征图谱结合定量的一测多评简便快捷，稳定可靠，可在只消耗五味子醇甲对照品的情况下较全面地反映醋五味子其他成分信息，有助于提升饮片及其制剂的质量控制水平。因此，建议在醋五味子标准项下增补特征图谱，规定应稳定地出现16 个特征峰，各峰之间具有相对稳定的比例关系；一测多评法测得48 批醋五味子中4 种木脂素平均总含有量为1.04%，建议下调20%，即应不低于0.8%。

本研究基于特征图谱和一测多评法的醋五味子质量控制模式与现有国家标准相比，可反映各木脂素含有量控制水平，也能为进一步完善该炮制品的质量标准提供依据。