不同产地及变型天麻有效成分差异性分析

田孟华袁天军周 瑞杨新周

（1.昭通市天麻研究院，云南昭通 657000； 2.德宏师范高等专科学校民族医药研究所，云南德宏 678400； 3.德宏师范高等专科学校理工学院，云南德宏 678400； 4.云南华衡检测技术有限公司，云南昆明 650106）

天麻为兰科真菌营养型多年生草本植物天麻Gastrodia elataBl.的干燥块茎，是我国传统名贵中药材之一，始载于《神农本草经》，位列上品［1］，在中国等东亚国家已有上千年的应用历史［2］。现代药理研究表明，天麻对预防和治疗中枢神经系统、心血管、免疫系统疾病具有一定功效［3-5］，临床常用于治疗头晕目眩、肢体麻木、癫痫抽搐、小儿惊风、风湿痹痛等症［6-8］富含多种营养成分和矿质元素［9］，已广泛用于食品辅料，如“天麻蒸蛋”“天麻乌骨鸡”“天麻粥”等［10］。它作为药食同源滋补保健类药材，含酚酸、甾醇、有机酸、脂类、多糖等多种成分，其中酚酸中的天麻素（Gas）、天麻腺苷、对羟基苯甲醇（HA）、对羟基苯甲醛（HBA）、巴利森A （PA）、巴利森苷B （PB）、巴利森苷C （PC）、巴利森苷E （PE） 是主要活性物质［11-13］，具有镇痛、降压、抗惊厥、保护神经细胞等作用［14-15］，也是目前该药材及其中成药质量评价的重要指标成分［16］，但2015 年版《中国药典》 仅规定天麻素、对羟基苯甲醇总量不得低于0.25%［2］。中药材成分复杂，其多组分、多靶点协同作用于机体，符合中医整体论和系统论［17］，仅检测单一或少数成分难以有效评价药材质量。不同产地种植的天麻随栽培土壤、气候环境变化，其功效和有效成分含有量均有较大差异，王信等［18］建立了6 种天麻素类成分的一测多评法用于质量控制；王庆等［19-20］研究了西南地区 （云南、贵州、四川） 3 种变型天麻（红天麻、乌天麻、绿天麻）中多酚、多糖、氨基酸、天麻素、巴利森苷成分的含有量，发现不同产地、变种所含成分存在较大差异。本实验广泛采集全国主产地天麻，对其中8 种有效成分及总天麻素含有量进行分析，利用差异性、相关性、主成分、因子载荷分析对不同产地及变型品种有效成分的差异特征及影响因素进行探析，筛选相关标志物，以期为药材质量评价及其产地、变型鉴别提供科学依据。

1 材料

LC-20A 型RP-HPLC 色谱仪 （配置LC-20AT高压双泵、SPD-20A 检测器、SIL-20A 自动进样器，岛津企业管理有限公司）；CP124C 电子分析天平 （万分之一，奥豪斯仪器有限公司）；CP1502C 电子分析天平（奥豪斯仪器有限公司）；HWS28 型电热恒温水浴锅（上海一恒科学仪器有限公司）；RE-3000A 型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）。

甲醇、乙腈、磷酸均为色谱纯；乙醇、氢氧化钠等其他试剂均为分析纯；水为超纯水。腺苷对照品购于中国食品药品检定研究院；天麻素、对羟基苯甲醇、对羟基苯甲醛、巴利森苷、巴利森苷B、巴利森苷对照品C 均购于上海源叶生物科技有限公司。

天麻采自云南、四川、湖北、贵州、陕西、安徽、甘肃、吉林等省，其中省外13 个、省内8 个，经昭通市天麻研究院田孟华工程师鉴定为正品，具体见表1。样品切片自然晾干后粉碎，过0.3 mm筛，装入自封袋中贮存备用。

2 方法

2.1 色谱条件 Inert Sustain C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相0.1% 甲酸（A） -乙腈（B），梯度洗脱 （0～8 min，1%～2% B；8～15 min，2%～8% B；15～25 min，8% B；25～35 min，8%～15% B；35～45 min，15% B；45～50 min，15%～20%B；50～60 min，20%B）；体积流量1.0 mL／min；检测波长270 nm；柱温35 ℃；进样量10 μL。

2.2 对照品溶液制备及线性关系考察 乙腈-水（10∶ 90） 混合溶液将各对照品制成含腺苷0.020 4 mg／mL、天麻素0.100 8 mg／mL、对羟基苯甲醇0.062 8 mg／mL、对羟基苯甲醛0.010 0 mg／mL、巴利森苷A 0.200 4 mg／mL、巴利森苷B 0.201 6 mg／mL、巴利森苷C 0.200 8 mg／mL、巴利森苷E 0.202 4 mg／mL的溶液，即得。以溶液质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y） 进行回归，结果见表2，可知各成分在各自范围内线性关系良好。色谱图见图1。

表1 样品信息Tab.1 Information of samples

表2 各成分线性关系Tab.2 Linear relationships of various constituents

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.3 供试品溶液制备 精密称取样品2 g，置于具塞三角瓶中，精密加入70% 乙醇50 mL，称定质量，90 ℃水浴回流3 h，冷却至室温，70%乙醇补足减失的质量，滤过，吸取10 mL 滤液2 份，蒸干。其中，1 份用10%乙腈溶解，转移至10 mL 量瓶中，10%乙腈定容，摇匀，0.45 μm 微孔滤膜过滤，取滤液，即得。

另1 份用2%氢氧化钠-10%乙腈混合溶液5 mL溶解，转移至10 mL 量瓶中，摇匀，室温放置2 h充分水解，5% 盐酸调pH 至4～5，10% 乙腈稀释5～10倍，摇匀，0.45 μm 微孔滤膜过滤，取滤液，作为总天麻素待测液。

3 结果

3.1 成分分析 表3 显示，HBA、腺苷含有量以云南普洱21＃样品最高，变异最小；Gas、PB 含有量以云南丽江19＃样品最高，差异较大；云南昭通14＃、四川乐山1＃样品、安徽安庆8＃、贵州同仁4＃样品分别以PB、HA、PC、PA 含有量最高。由此可知，不同产地间有效成分含有量存在一定差异。

3.2 相关性分析 表4 显示，天麻中不同有效成分含有量之间存在一定的相关性，其中腺苷与HA呈负显著相关，与PE 呈显著相关；PB、PC、PA、总天麻素与Gas 之间呈显著或极显著相关，HBA与P 呈显著负相关。由此推测，可能存在相互转化或累积代谢途径的相互影响。

表3 不同产地样品成分分析（mg／g）Tab.3 Composition analysis of samples from different growing areas （mg／g）

表4 天麻素及其他有效成分之间的相关性Tab.4 Correlations between gastrodin and the other effective components

3.3 天麻有效成分对不同产地的影响 采用SPSS 19.0 软件结合SIMCA P ＋10.5 软件对不同产地天麻有效成分含有量进行主成分分析，提取主成分数，并探析它对产地分类的影响。结果见表5、图2～3。

表5 中，对不同产地21 批样品中8 种有效成分及总天麻素采用最大方差化旋转后降维分析，根据初始特征值≥1 的原则，发现不同成分对产地均具有一定影响，所提取的4 种主成分累积影响因子达85.161%，Gas、PB、PC、PA、总天麻素对第1主成分具有较大贡献，腺苷、HBA 对第2 主成分具有较大贡献，HA 对第3 成分具有较大贡献，PE对第4 主成分具有较大影响。其中，第1、2 主成分总累积贡献率为53.911%，接近60%，表明两者所提取的因子贡献率对产地分析具有较大影响。

表5 旋转后不同产地样品有效成分提取结果Tab.5 Extraction results of effective components in samples from different growing areas after rotation

图2 21 批样品主成分分析图Fig.2 Principal component analysis plot for twenty-one batches of samples

由图2 可知，8 种有效成分及总天麻素含有量可将不同产地样品进行有效分类。其中，在主成分1、2 空间中云南、吉林产地样品能有效分类，而四川、贵州、湖北产地样品与云南产地较为接近，这可能与产地间的生态环境相近有关。图3 表明，第1 主成分提取的HA、HBA、PE 对四川、云南产地样品分类的影响较大，而PB、总天麻素、Gas、PA、PC 腺苷对湖北、陕西、贵州等产地样品的分类具有较大影响，尤其是对湖北、陕西；第2 主成分提取的HA、HBA、PE、PB、Gas 对四川、云南、湖北产地样品的分类具有正贡献，而腺苷、PA、PC 对陕西、贵州、甘肃、安徽产地样品的分类具有较大影响。由此显示，不同产地天麻有效成分对其分类具有不同程度的影响。

图3 各成分载荷图Fig.3 Loading diagram of various constituents

3.4 天麻有效成分对不同变型天麻的影响 进一步分析天麻内在有效成分含有量对不同变型天麻的影响，结果见表6、图4～5。

由表6 可知，提取的3 个主成分因子对变型分类的贡献率达81.9%，表明三者能有效识别不同变型的样品。

表6 不同变型主要有效成分提取结果（%）Tab.6 Extraction results of main active ingredients in different varieties （%）

图4 不同变型主成分分析图Fig.4 Principal component analysis plot of different variations

由图4 可知，8 种有效成分和总天麻素含有量可将不同变型天麻样品进行有效分类。其中，在主成分1、2 空间中乌绿天麻、乌天麻、绿天麻间存在较大差异，而黄天麻、红天麻、乌红天麻之间差异不明显。对不同变型样品进行载荷分析时发现，Gas、HA、PE、PB、总天麻素对乌天麻分类具有较大的正贡献，而PA 具有较大的负贡献，其中PE、PA 可作为它与其他天麻变型之间差异性分析的标志性物质；腺苷、HA 对绿天麻分类分别具有较大负、正贡献，可作为其分类的模式物质；乌红天麻、黄天麻、红天麻之间相似度较高，主要区别在于HA、PE、PC、总天麻素、PA；乌绿天麻与其他天麻均具有较大差异，主要表现为除了HBA对其分类有正贡献外，其余指标均呈负贡献。

图5 有效成分对变型分类贡献的影响Fig.5 Effects of active ingredients on classification contribution of varieties

4 讨论与结论

不同产地种植的天麻随栽培土壤、气候环境变化，其有效成分含有量均具有较大差异。本实验结果显示，不同产地样品8 种有效成分及总天麻素含有量具有一定差异，提取的特征成分可在主成分空间内有效识别产地差异，也可用于不同变型的差异性识别，尤其是PE、PA，可作为乌天麻与其他天麻变型之间差异性分析的标志物；腺苷、HA 对绿天麻分类分别具有较大负、正贡献，可作为其分类的模式物质。综上所述，该方法可为后续天麻及其不同变型品质的评价及鉴定提供新思路。