美洲大蠊提取物对2，4，6-三硝基苯磺酸诱导大鼠溃疡性结肠炎的影响

陶 磊，陈金虎，张汉超，刘 彬，陈 莹，万 苹，何 苗*，杨志斌*

（1.大理大学，云南省昆虫生物医药研发重点实验室，云南大理 671000； 2.药用美洲大蠊四川省重点实验室，四川成都 610000； 3.大理白族自治州人民医院病理科，云南大理 671000； 4.云南省第一人民医院消化内科，云南大理 671000）

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC） 属于炎症性肠病范畴，是一种以肠黏膜炎症、溃疡糜烂为病理特征的急、慢性结直肠病症，其UC 临床病症难以治疗，易复发，具有癌变倾向，被列为难治愈疾病之一［1］。现代医学认为UC是在遗传、环境等多种因素共同影响下，神经内分泌失调和免疫失衡，导致肠黏膜屏障损伤引起局部黏膜溃疡［2］。目前西医临床治疗药物主要为氨基酸水杨酸类、免疫抑制剂类、糖皮质激素类、生物制剂类，但多数药物不良反应多，疗效不稳定且伴有多种并发症，生物制剂类还因价格昂贵、来源途径窄、易耐受，使其在临床使用上受到一定限制［3］；而中医常辨证施治，以单方或复方汤剂、中成药治疗UC，且较西医有不良反应少、可缓解临床症状和降低复发率的优势［4］。现代药理学研究发现，中药主要通过多成分协同调节免疫和抗炎途径达到缓解及治疗UC［5］。

美洲大蠊Periplaneta americanaL.是蜚蠊科大蠊属昆虫，最早记载于《神农本草经》。其主要含有信息素、生物碱及神经肽类等化学成分，具有组织修复、抗癌、消炎消肿、抗菌等作用［6］。基于课题组前期发现［7］美洲大蠊提取物能缓解UC 疾病活动情况，降低死亡率，故本次拟通过三硝基苯磺酸／乙醇法构建大鼠UC 模型，研究美洲大蠊提取物对UC 大鼠的影响并初步探讨其作用机制。

1 材料

1.1 动物 SPF 级SD 大鼠，180～220 g，雌雄各半，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，使用许可证号SYXK （滇） -2011-0004。

1.2 试剂与药物 美洲大蠊购自好医生药业集团，经大理大学昆虫生物医药研究院动物学教授杨自忠鉴定为蜚蠊目蜚蠊科大蠊属美洲大蠊Periplaneta americanaL.。取美洲大蠊干品，70% 乙醇加热回流提取3 次，过滤，合并滤液，浓缩至密度1.25 g／mL，加水脱脂，过滤，滤液浓缩至浸膏，即得美洲大蠊提取物（批号20150317，药用特种昆虫开发国家地方联合工程研究中心张成桂副教授提供）。柳氮磺胺吡啶肠溶片（批号20160505） 购自上海信谊天平药业有限公司；肠炎宁（批号Z36020518） 购自江西天施康弋阳制药有限公司；MPO 试剂盒（批号20161209）、隐血试剂盒（批号20160824） 购自南京建成生物工程研究所；IL-17 试剂盒（批号R161025-170b）、IL-4 试剂盒（批号R160927-002b） 购自欣博盛生物科技有限公司；IFN-γ 试剂盒（批号E3000-1609-1）、EGF 试剂盒 （批号R161214-104a）、TGF-β1 试剂盒（批号R161101-107a）、TNF-α 试剂盒（批号E3720-1680-2） 购自达科为生物科技有限公司。

1.3 仪器 HC-3018R 型高速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）；先行者CP214 型电子天平（奥豪斯仪器有限公司）；医学图像分析系统BI-2000 （成都泰盟科技有限公司）。

2 方法

2.1 造模 74 只SPF 级SD 大鼠，正常饲养7 d，根据张汉超等［8］报道的方法对大鼠进行造模，10% 水合氯醛（3 mL／kg） 麻醉大鼠后将其倒立，直径2 mm 聚乙烯管轻轻插入大鼠肛门深度约8 cm，将0.6 mL 5%三硝基苯磺酸的30%乙醇溶液由注射器经导管缓慢灌注，拔出聚乙烯管并将大鼠进行10 s 倒立。正常对照组同等操作灌肠给予等体积氯化钠注射液。

2.2 分组及给药 三硝基苯磺酸／乙醇法致大鼠UC 模型建立后第7 天，参考Hamamoto 等标准［9］进行疾病活动指数（disease activity index，DAI） 评分，根据DAI 评分（0～3 分，极轻度炎症；4～6 分，轻度炎症；7～9 分，中度炎症；10～12 分，重度炎症） 进行分组，选择可纳入实验的轻中度炎症造模大鼠60 只。根据DAI 评分分层后随机分为模型组，肠炎宁组（600 mg／kg），柳氮磺胺吡啶组（300 mg／kg），美洲大蠊提取物低 （50 mg／kg）、中（100 mg／kg）、高（200 mg／kg） 剂量组，于模型建立第8天进行相应给药治疗，灌胃给药，其中正常对照组和模型组给予氯化钠注射液，1 次／d，连续14 d。给药第1、4、7、14 天进行DAI 评分。

2.3 血清IL-4、TNF-α、IFN-γ、IL-17 水平测定 末次给药后禁食不禁水24 h，水合氯醛麻醉大鼠，腹主动脉取血于4 ℃静置凝固，以3 000 r／min 离心10 min 取血清，采用ELISA 法检测IL-4、TNF-α、IFN-γ、IL-17 水平。

2.4 肝脏、脾脏、胸腺和结肠指数 取出肝、脾、胸腺、结肠后，生理盐水涮洗干净后用滤纸将多余液体吸附，称定质量，计算相应脏器指数，脏器指数＝脏器质量／体质量。

2.5 结肠黏膜损伤指数评分 肉眼观察结肠组织黏膜损伤情况，参照Luk 等［10］标准进行结肠黏膜损伤指数（Colonmucosa damage index，CMDI） 评分。

2.6 结肠EGF、TGF-β1、MPO 水平测定 取结肠病变部位组织0.15 g，生理盐水按1∶9比例匀浆，离心后取上清液，ELISA 法检测EGF、TGF-β1 水平，试剂盒检测MPO水平。

2.7 结肠病理形态观察 取约0.5 cm×0.5 cm 病变部位结肠，福尔马林溶液固定，HE 染色，光学显微镜下观察病理切片，参照Ekström 等［11］标准并进行结肠结肠病理形态观察评分（histopathological score，HS）。

2.8 统计学分析 采用SPSS 20.0 进行分析。数据以（）表示，服从正态分布，多组间比较采用单因素方差分析；不服从正态分布，采用秩和检验，以P≤0.05 表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 美洲大蠊提取物对UC 大鼠DAI 评分的影响 建模后第1 天，与正常对照组比较，其余各组大鼠出现毛色无光泽、少动嗜睡、厌食、大便隐血或血便等现象。给药第1天各造模组大鼠DAI 评分较正常对照组升高（P＜0.01）。给药第14 天，模型组DAI 评分较正常对照组仍升高（P＜0.01），提示模型持续存在；经柳氮磺胺吡啶、肠炎宁、美洲大蠊提取物干预后，大鼠粪便部分由水样稀便转为较松散稀便，粪便隐血减少，活动增强、体质量增加；与模型组比较，美洲大蠊提取物组和柳氮磺胺吡啶组DAI评分降低（P＜0.01）；与肠炎宁组比较，美洲大蠊提取物低、中剂量组DAI 评分降低（P＜0.01）；与柳氮磺胺吡啶组比较，美洲大蠊提取物中剂量组DAI 评分降低（P＜0.05）。见表1。

表1 美洲大蠊提取物对UC 大鼠DAI 评分的影响（， n＝10）

表1 美洲大蠊提取物对UC 大鼠DAI 评分的影响（， n＝10）

注：与正常对照组比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01；与模型组比较，△△P ＜0.01；与柳氮磺胺吡啶组比较，▲P ＜0.05；与肠炎宁组比较，▽P＜0.05，▽▽P＜0.01。

3.2 美洲大蠊提取物对UC 大鼠脏器指数的影响 如表2所示，与正常对照组比较，模型组结肠指数升高（P＜0.01），肝脏、脾脏、胸腺指数无影响。美洲大蠊提取物组大鼠结肠指数较模型组、柳氮磺胺吡啶组和肠炎宁组降低（P＜0.05，P＜0.01）。

表2 美洲大蠊提取物对UC 大鼠脏器指数的影响（mg／g，， n＝10）

表2 美洲大蠊提取物对UC 大鼠脏器指数的影响（mg／g，， n＝10）

注：与正常对照组比较，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与柳氮磺胺吡啶组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；与肠炎宁组比较，▽P＜0.05，▽▽P＜0.01。

3.3 美洲大蠊提取物对UC 大鼠CMDI 评分的影响 如表3、图1 所示，与正常对照组比较，模型组大鼠肠壁有明显充血、水肿、溃疡形成，结肠黏膜病变严重，结肠长度和长宽比减小，CMDI 评分升高（P＜0.01）；与模型组比较，美洲大蠊提取物低剂量组结肠长度升高（P＜0.01），美洲大蠊提取物各剂量组结肠长宽比升高、CMDI 评分降低（P＜0.05，P＜0.01）；与柳氮磺胺吡啶组比较，美洲大蠊提取物各剂量组结肠长宽比升高（P＜0.01），CMDI 评分下降（P＜0.01）。

表3 美洲大蠊提取物对UC 大鼠结肠CMDI 评分的影响（， n＝10）

表3 美洲大蠊提取物对UC 大鼠结肠CMDI 评分的影响（， n＝10）

注：与正常对照组比较，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与柳氮磺胺吡啶组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；与肠炎宁组比较，▽P＜0.05，▽▽P＜0.01。

图1 美洲大蠊提取物对UC 大鼠结肠黏膜的影响

3.4 美洲大蠊提取物对UC 大鼠血清IL-4、IL-17、TNF-α、IFN-γ 水平的影响 如表4 所示，与正常对照组比较，模型组大鼠血清IL-4 水平降低 （P＜0.01），TNF-α、IL-17、IFN-γ水平升高（P＜0.01）。与模型组比较，各给药组大鼠血清IFN-γ、TNF-α 水平降低（P＜0.01）；肠炎宁组和美洲大蠊提取物低、中剂量组IL-4 水平升高（P＜0.01）；除美洲大蠊提取物PABA1 低剂量组外，其他给药组IL-17水平降低（P＜0.01）。与柳氮磺胺吡啶组比较，美洲大蠊提取物各剂量组TNF-α、IL-17 水平均降低（P＜0.05，P＜0.01），低、中剂量组IL-4 水平升高（P＜0.05）；与肠炎宁组比较，美洲大蠊提取物各剂量组IL-17 水平降低（P＜0.01）。

表4 美洲大蠊提取物对UC 大鼠血清IL-4、IL-17、TNF-α、IFN-γ 水平的影响（， n＝10）

表4 美洲大蠊提取物对UC 大鼠血清IL-4、IL-17、TNF-α、IFN-γ 水平的影响（， n＝10）

注：与正常对照组比较，**P ＜0.01；与模型组比较，△△P ＜0.01；与柳氮磺胺吡啶组比较，▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01；与肠炎宁组比较，▽▽P＜0.01。

3.5 美洲大蠊提取物对UC 大鼠结肠EGF、TGF-β1、MPO水平的影响 如表5 所示，与正常对照组比较，模型组大鼠结肠EGF、TGF-β1 水平降低，MPO 水平升高（P＜0.01）；与模型组比较，美洲大蠊提取物各剂量组EGF、TGF-β1 水平升高（P＜0.01），美洲大蠊提取物中剂量组MPO 降低（P＜0.01）；与硫柳氮磺胺吡啶组和肠炎宁组比较，美洲大蠊提取物各剂量组EGF 水平升高（P＜0.01）。

表5 美洲大蠊提取物对UC 大鼠结肠EGF、TGF-β1 及MPO 水平的影响（， n＝10）

表5 美洲大蠊提取物对UC 大鼠结肠EGF、TGF-β1 及MPO 水平的影响（， n＝10）

注：与正常对照组比较，**P ＜0.01；与模型组比较，△△P ＜0.01；与柳氮磺胺吡啶组比较，▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01；与肠炎宁组比较，▽▽P＜0.01。

3.6 美洲大蠊提取物对UC 大鼠结肠病理组织学的影响如表6、图2 所示，除正常对照组外，其他组大鼠结肠黏膜呈不同程度溃疡并伴有炎性细胞浸润。模型组结肠HS评分高于正常对照组（P＜0.01）。美洲大蠊提取物各剂量组结肠HS 评分较模型组和硫柳氮磺胺吡啶组降低（P＜0.05，P＜0.01）。

表6 美洲大蠊提取物对UC 大鼠HS 评分的影响（， n＝10）

表6 美洲大蠊提取物对UC 大鼠HS 评分的影响（， n＝10）

注：与正常对照组比较，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与柳氮磺胺吡啶组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；与肠炎宁组比较，▽P＜0.05。

4 讨论

由三硝基苯磺酸／乙醇法诱导UC 大鼠模型是一种公认的造模方法。乙醇介导肠黏膜屏障破损，三硝基苯磺酸与肠黏膜组织蛋白结合成完全抗原，使T 淋巴细胞致敏，引起肠壁免疫应答和炎症反应［12］，其中CD4＋T 淋巴细胞引起的肠道损伤具有特征性和复发性。CD4＋T 淋巴细胞分为Th1 和Th2 亚群，Th1 可诱发迟发型超敏反应，触发免疫反应及炎症发生，Th2 可降低机体免疫反应。在外来抗原刺激下，Th1、Th2 细胞激活并分化，其平衡状态破坏，导致免疫功能紊乱［13］。本实验采用三硝基苯磺酸／乙醇法诱导大鼠溃疡性结肠炎，各造模组大鼠于给药第1 天其DAI 较正常对照组均显著增加，给药结束时模型组DAI 评分较正常对照组仍显著增加，提示模型持续存在，经美洲大蠊提取物治疗后与模型组、柳氮磺胺吡啶组和肠炎宁组相比其DAI 均降低。

图2 HE 染色检测各组大鼠结肠病理组织学（×100）

TNF-α 由Th1 细胞和中性粒细胞分泌释放，具有增加肠道上皮细胞通透性，启动病理性Th1 介导的细胞免疫，破坏肠粘膜屏障功能［14］，促进Th1 分泌产生INF-γ，进而激活吞噬细胞及中性粒细胞，加重炎性反应。模型组TNF-α、IFN-γ 水平升高，经美洲大蠊提取物治疗后抑制TNF-α、IFN-γ 表达，减缓炎症，且美洲大蠊提取物治疗后TNF-α 与肠炎宁组表达相当，较柳氮磺胺吡啶组降低。IL-4 由Th2 型细胞分泌，通过抑制IFN-γ、TNF-α 产生，达到抑制炎症反应并维持肠道免疫平衡的作用。美洲大蠊提取物治疗后血清IL-4 水平显著升高，说明美洲大蠊提取物能通过增强抑制炎症达到回调Th1／Th2 失衡的作用。

IL-17 主要是由CD4＋T 细胞分泌促炎效应因子，可活化T 细胞和刺激巨噬细胞产生多种炎症因子，在炎症发生过程中起重要调控作用［15］。MPO 由中性粒细胞分泌，其含有量升高会导致炎性细胞增殖和活化，导致炎症部位组织细胞损伤，其活性间接反映肠道炎症程度［16］。EGF、TGF-β1可促使分化基因表达及诱导细胞生长迁移，维持上皮细胞正常新陈代谢［17-18］，实验结果显示模型组EGF 和TGF-β1 水平显著下降，经美洲大蠊提取物治疗后UC 大鼠结肠长度增长，CMDI 评分减少，上皮细胞恢复、炎性细胞浸润程度降低，与结肠组织中EGF、TGF-β1 升高趋势一致，提示美洲大蠊提取物能刺激细胞生长修复从而促进肠黏膜屏障功能恢复。但是美洲大蠊提取物各剂量组疗效有所差别，推测经灌胃给药后，美洲大蠊提取物可能通过多成分、多靶点、多途径发挥治疗作用使实验呈非线性结果［19］，后期将深入研究美洲大蠊提取物的量效关系。