西红花苷对巨噬细胞泡沫化中炎症和脂质代谢的影响

刘冬冬，屈宝泽，李今朝

（1.锦州医科大学，辽宁锦州 121000； 2.锦州医科大学附属第一医院，辽宁锦州 121000）

动脉粥样硬化 （atherosclerosis，AS） 是一种由多因素引起的，以高度特异性的细胞分子反应为特征的慢性炎症过程，主要累及大、中动脉。其病因尚不清楚，但动脉粥样硬化的发病机制与炎症中发生的几种现象有关，包括巨噬细胞的激活、促炎细胞因子的释放、生长因子的过度分泌和淋巴细胞的局部活化［1］。尽管动脉粥样硬化的基础和临床研究取得了很大进展，但它仍然是目前最常见的心血管疾病之一，也是世界上导致死亡的主要原因之一［2-3］。炎症在AS 的发生发展中起着关键作用，在动脉粥样硬化斑块形成期间，循环的单核细胞进入血管壁的内皮下并转化为巨噬细胞，随后吞噬氧化的低密度脂蛋白 （OX-LDL） 后变成泡沫细胞［4］，泡沫细胞是动脉粥样硬化病变的标志［5］。因此，如何抑制泡沫细胞的形成及以炎症为研究目标，或成为治疗动脉粥样硬化的关键。

西红花为鸢尾科植物番红花Crocus sativusL.的干燥柱头，是自然界存在的唯一水溶性类胡萝卜素。近年来国内外大量研究表明，西红花苷在抗心血管系统疾病、抗氧化［6］、抗高血压、抗动脉粥样硬化［7］、抗炎［8］、防治糖尿病并发症等方面有很高的药用价值。虽然西红花苷的药理作用十分广泛，但是西红花苷的药理机制目前研究尚少。本实验从炎症的角度出发，探讨西红花苷通过抑制脂质代谢及相关炎症因子，进而抑制泡沫细胞的形成，发挥抗AS的作用。

1 材料

1.1 细胞 小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7 购自沈阳万类生物科技有限公司。

1.2 试剂与药物 西红花苷（批号42553-65-1，纯度≥98%） 购自上海源叶生物科技有限公司；氧化性低密度脂蛋白（OX-LDL，批号LW-6002，纯度98%，2 mg）、油红O 染色试剂盒、白介素1β （IL-1β） ELISA 检测试剂盒、肿瘤坏死因子α （TNF-α） ELISA 检测试剂盒、BCA 蛋白浓度测定试剂盒、MTT 均购自沈阳万类生物科技有限公司；单核细胞趋化蛋白1 （MCP-1） 检测试剂盒购自优尔生商贸有限公司；总胆固醇（T-CHO） 试剂盒购自南京建成生物工程研究所；p65、GAPDH 抗体均购自英国Abcam 公司。

1.3 仪器 超速冷冻离心机（H-2050R，湖南长沙湘仪检测设备有限公司）；CO2培养箱（HF-90，上海力申科学仪器有限公司）；倒置相差显微镜（IX-53，日本Olympus 公司）；酶标仪（ELX-800，美国BioTek 公司）。

2 方法

2.1 细胞培养 将小鼠腹腔巨噬细胞RAW 264.7 用含10%胎牛血清的DMEM 培养基于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养，当细胞生长至为90% 左右，加入胰酶消化细胞，按1∶2 进行传代。

2.2 分组及给药 分为正常组、模型组及西红花苷低、中、高剂量组。将细胞接种于6 孔板中，待细胞贴壁后，正常组细胞正常培养基培养，模型组组加入50 μg／mL 氧化低密度脂蛋白，西红花苷低、中、高剂量组加入50 μg／mL的氧化低密度脂蛋白和0.01、0.1、1 μmol／L 西红花苷，细胞处理12、24、48 h。

2.3 油红O 染色鉴定泡沫细胞模型 （1） 漂洗，弃上清，用37 ℃PBS 漂洗2 次；（2） 固定，加入4% 多聚甲醛室温固定20 min；（3） 染色，吸弃多聚甲醛，加入1.5 mL油红O 染色15 min；（4） 脱色，吸弃染色液，向培养板孔中加入1.5 mL 75% 乙醇，除去多余染色液，再用PBS 漂洗2 次，至没有可见的红色物质漂浮；（5） 晾片，用干净的镊子取出盖玻片，置于干净的台面上晾干；（6） 封片，用甘油明胶封片；（7） 显微镜下观察并拍照。

2.4 MTT 法筛选药物最适时间及浓度梯度 将细胞接种于96 孔板中，5×103／孔，每组设置5 个复孔，待细胞贴壁后依次加入0.01、0.1、1、10、100 μmol／L西红花苷，放入37 ℃、5% CO2培养箱中处理12、24、48 h。将达到特定时间的各组细胞弃去培养基，更换成0.5 mg／mLMTT 混合液，置于37 ℃、5% CO2培养箱中孵育4 h。4 h 后小心吸去上清，加入150 μL DMSO 以溶解细胞形成的紫色结晶，避光静置10 min 后在酶标仪上测定其在570 nm 处OD。

2.5 细胞上清液指标检测 取各组细胞上清，COD-PAP单试剂比色法检测总胆固醇水平、ELISA 检测IL-1β、TNF-α、MCP-1 水平，严格按照试剂盒说明书进行操作。

2.6 Western blot 检测NF-κB 蛋白表达 采用BCA 法检测蛋白浓度，用SDS-PAGE 分离蛋白，将蛋白转移至PVDF膜，用5% 脱脂牛奶封闭1 h，加入一抗，4 ℃摇床孵育过夜，TBST 漂洗3 次，加入二抗（1∶5 000），室温下摇床孵育2 h，TBST 漂洗3 次；免疫印迹显色，Image-J 软件定量分析蛋白条带灰度值。

2.7 统计学分析 采用SPSS 19.0 软件进行分析，计量资料以（） 表示，符合正态分布采用F及q检验，不符合正态分布采用秩和检验，不同时间点采用重复测量方差分析，组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 细胞图片及油红O 染色鉴定 细胞图片如图1 所示，染色结果如图2 所示，细胞内充满橘红色脂滴，细胞形态如同指环，说明泡沫细胞造模成功。

3.2 西红花苷对细胞活性的影响 MTT 法检测结果显示，在0.01～100 μmol／L 范围内，西红花苷对RAW264.7 细胞的增殖作用逐渐减弱，同一组内随培养时间的延长细胞活性逐渐增加（图3）。选取0.01、0.1、1 μmol／L 西红花苷进行后续实验。

3.3 西红花苷对泡沫细胞总胆固醇（T-CHO） 水平的影响 与正常组比较，模型组胆固醇水平增加（P＜0.01）；与模型组比较，西红花苷高剂量组胆固醇水平下降（P＜0.05）。见表1。

3.4 西红花苷对泡沫细胞IL-1β、TNF-α、MCP-1 水平的影响 与正常组比较，模型组IL-1β、TNF-α、MCP-1 水平上调（P＜0.01）；与模型组比较，西红花苷中、高剂量组IL-1β、TNF-α、MCP-1 水平下调（P＜0.05，P＜0.01）。给药后时间对同一药物组影响不大，不同时间点所测同一药物组IL-1β 水平差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2～4。

图1 各组细胞形态

图2 细胞油红染色（×400）

图3 0.01～100 μmol／L 西红花苷对RAW264.7 细胞增殖的影响

表1 不同浓度西红花苷对T-CHO 水平的影响（mmol／g prot，， n＝3）

表1 不同浓度西红花苷对T-CHO 水平的影响（mmol／g prot，， n＝3）

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，＃P＜0.05。

表2 不同浓度西红花苷对IL-1β 水平的影响（pg／mL，， n＝3）

表2 不同浓度西红花苷对IL-1β 水平的影响（pg／mL，， n＝3）

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

表3 不同浓度西红花苷对TNF-α 水平的影响（pg／mL，， n＝3）

表3 不同浓度西红花苷对TNF-α 水平的影响（pg／mL，， n＝3）

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

表4 不同浓度西红花苷对MCP-1 水平的影响（pg／mL，， n＝3）

表4 不同浓度西红花苷对MCP-1 水平的影响（pg／mL，， n＝3）

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.5 西红花苷对泡沫细胞炎症通路NF-κB 的影响 与正常组比较，模型组NF-κB 蛋白表达上调（P＜0.01）；与模型组比较，西红花苷各药物组NF-κB 蛋白表达降低（P＜0.01），且随药物浓度的增加，NF-κB 蛋白表达呈剂量依赖性下降；与西红花苷低剂量组比较，西红花苷高剂量组NF-κB 蛋白表达下调（P＜0.05）。见图4。

4 讨论

AS 的发病机制复杂，曾有多种学说从不同的角度阐述，包括脂质代谢紊乱学说、内皮损伤学说、炎症反应学说、壁面切应力等。近年来“炎症-反应-损伤”学说得到广泛的支持，起源于单核细胞或巨噬细胞的多种细胞因子，如异常的炎症趋化因子、细胞因子等参与动脉粥样硬化进程［9-10］。NF-κB 是一种关键的核转录因子，与炎症反应的调节密切相关［11］。NF-κB 信号通路在AS 的发生发展中起着重要的作用，此信号通路的激活是炎症反应的核心，泡沫细胞的形成是AS 早期的炎症细胞。NF-κB 在正常的血管中含有量很少，在AS 中的巨噬细胞和内皮细胞NF-κB 被大量的激活，说明NF-κB 参与了AS 的调控［12-13］。NF-κB信号通路相关信号有TNF-α、IL-1β、MCP-1，这些炎症因子受NF-κB 的调控，可以影响NF-κB 的活化。

近几年，中药抗AS 日渐成为研究的热点，越来越多的中药复方和提取物已经被成功运用到AS 和冠心病的治疗中［14］，其作用温和、毒副作用小、不易残留、免疫药理调节作用明显，在预防和治疗心血管疾病方面，具有明显优势［15-16］。研究发现，西红花苷在降脂、抗炎、抗AS、抗血小板聚集及心脏保护方面具有显著的药理作用。Zheng等［17］研究显示，高脂饮食喂养的家兔在主动脉中出现严重的高胆固醇血症和动脉粥样硬化，同时VCAM-1 的蛋白和mRNA 表达均显着上调，而给予西红花苷的家兔可显着改善动脉粥样硬化，同时VCAM-1 表达显着降低。表明西红花苷具有抗AS 的作用，其机制可能是降低NF-κB 的活性，抑制血管细胞黏附分子-1 （VCAM-1） 表达，从而发挥抗AS 的作用。

图4 西红花苷对泡沫细胞炎症通路NF-кB 的影响

在本研究中，用50 μg／mL 氧化性低密度脂蛋白（OX-LDL）诱导建立泡沫细胞模型。各药物组中胆固醇的水平均低于模型组，且随给药浓度增加胆固醇的水平逐渐降低，表明西红花苷具有降脂作用。各药物组中炎症因子的水平均低于模型组，且随给药浓度的增加逐渐降低，表明西红花苷对炎症因子IL-1β、TNF-α、MCP-1 有抑制作用。各药物组中NF-κB 表达均低于模型组，表明西红花苷可以通过抑制NF-κB 通路活性来发挥抗AS 的作用。

综上所述，西红花苷可降低泡沫细胞中胆固醇及相关炎症因子水平，并且可能通过抑制NF-κB 信号通路来实现的。