EGCG对体外培养宫颈癌 HeLa 细胞增殖、凋亡和迁移的影响①

张 燕，邢天容，吴英杰，宋继荣

(佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154003)

绿茶中含有的表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)单体，不仅含量高，且有着较强的活性[1]。但目前，在宫颈癌中，关于EGCG报道较少，本文特对EGCG对体外培养宫颈癌 HeLa 细胞增殖、凋亡和迁移的影响进行探讨，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 药物试剂和仪器

选择美国Sigma公司碘化丙啶(PI)、EGCG、噻唑喃(MTT)；美国Costar公司Transwell小室；美国Santa Cruz公司VEGF鼠抗人单克隆抗体；美国Bio-Rad公司Mod550型全自动酶标仪；美国Coulter公司Epics Elite ESP型细胞仪。

1.2 细胞增殖检查

采取CCK-8法对细胞增殖进行检测，选择临床医学研究所体外培养宫颈癌HeLa 细胞株，用小牛血清10%将其培养在RPMI1640培养基中，温度保持在37℃，饱和湿度保持在5%CO2，每间隔2～3d需使用胰酶0.25%进行消化，传代为1:2，选择指数生长期中的HeLa 细胞，接种孔板规格为1×104个/mL的96孔板，原培养液需在24h吸出，并在RPMI 1640中加入0mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L、40mg/L、80mg/L、160mg/L EGCG，复孔每组可设置5个，分别培养14h、48h、72h再将清液吸出，将10uL MTT试剂分为5mg/mL注入到每个孔中，2h后再将清液吸出，加入二甲基亚砜150μL，作用时间为30min，将波长调整为750nm，对吸光度A值进行读取。

1.3 细胞周期、凋亡检测

各组细胞在处理48h后，收集0mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L、40mg/L EGCG，PBS 0.01mol/L，重悬细胞5mL，1mL乙醇(70%)，在-20℃条件下将其固定24h，在加入50μL/mL浓度的PI和0.25mg/mL浓度的RNA酶，将室温调整到适宜状态，于阴凉处孵育30min，DNA可通过流式细胞仪对其进行分析，再通过ModFit LT对各时细胞百分比进行计算。

1.4 细胞迁移检测

细胞接种24h后，将培养板中培养液去除，培养孔底部使用移液枪头10μL划一条划痕，通过无血清培养液对其进行洗涤，在注入胎牛血清1%后在培养24h，后在将培养液更换为胎牛血清10%在继续培养24h，划痕区迁移情况可通过显微镜仔细观察。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 EGCG对体外培养宫颈癌 HeLa 细胞增殖作用

在以上结果基础上，对通过EGCG对HeLa 细胞分别进行24h、48h、72h体外培养发现，EGCG可抑制细胞增殖，不同时间和剂量其依赖关系也不同，24h对应的半数抑制浓度IC50为130.2mg/L,48h对应的半数抑制浓度IC50为33.4mg/L,72h对应的半数抑制浓度IC50为21.7mg/L。

2.2 EGCG对体外培养宫颈癌 HeLa 细胞凋亡、迁移的影响

通过对以上筛选结果进行分析，处理48h后，分别对0mg/L、10mg/L、20mg/L、40mg/L EGCG对HeLa细胞凋亡、迁移进行分析，结果显示，细胞凋亡率在未经药物处理时相对较低，随着EGCG浓度增加，细胞凋亡率也随之升高；细胞周期分析结果显示，EGCG会致使G1期细胞增加，降低S期细胞比例，EGCG浓度越高，其影响越明显，见表1。

表1 EGCG对体外培养宫颈癌 HeLa 细胞凋亡、迁移的影响

3 讨论

宫颈癌是女性常见恶性肿瘤，据相关资料统计，每年约有18万人次，在世界总发病中占到1/3比例[2，3 ]，位居全球恶性肿瘤发病率中第2名，其病死率排名第4，每年全球约有25万人因宫颈癌死亡，发展中国家发病率和病死明显高于发达国家，均位居第2名。且近年来发病率呈不断上升趋势，并逐渐向年轻化发展，严重威胁女性身体健康。肿瘤转移和复发是致使宫颈癌患者死亡的主要因素。在目前临床治疗时，关于宫颈癌多采取放疗、化疗、手术等手段进行治疗，但手术治疗风险相对较大，易出现盆腔、泌尿系统感染、淋巴囊肿、术后出血等。通过化疗、放疗虽能对肿瘤细胞转移、增殖产生一定的抑制作用，但使用传统药物具有极强的毒性，且长期使用会使肿瘤产生一定的耐药性，加之，放疗和化疗对患者肾脏会产生一定损伤，出现骨髓抑制情况，因此，治疗效果有限[4]。关于肿瘤药物中，具有有效的细胞增殖抑制作用，促进肿瘤细胞凋亡，阻止继续迁移作用的药物，成为国内外临床研究一大热点。绿茶是一种健康的饮料，经研究发现，绿茶中所含物质具有抗肿瘤作用，如表儿茶素(EC)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)，表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)均属于绿茶中主要成分，具有抗衰老、抗氧化、清除自由基和防止紫外线作用[5，6]。相较于其他单体， EGCG不仅含量最高，且药理活性极强，抗氧化、降血压、降血糖、降脂、抗肿瘤作用更为显著，在心血管疾病中有着良好的预防效果，在肝癌、肺癌、胃癌、鼻咽癌、结肠癌等方面均有一定杀伤作用[6，7]。由于人体多细胞机体内环境主要依靠细胞凋亡进行维持和自我调节，细胞凋亡、细胞增殖之间相互处于平衡状态，才能保持人体内环境稳定[8]，因此，在肿瘤治疗中，细胞凋亡、细胞增殖同样具有重要意义。其中细胞凋亡属于细胞死亡的一种过程，具有多基因调控、程序化特征，促进患者细胞凋亡可达到肿瘤治疗目的，因此，在抗肿瘤治疗中，细胞凋亡已成为研究重点[9～10]。EGCG能抑制人体中肿瘤细胞增殖，并促进肿瘤细胞凋亡。研究表明，在10～100μg/mL 浓度范围内，EGCG对宫颈癌患者体内HeLa细胞具有明显的抑制作用。其依赖时间与EGCG计量有着直接关系。通过显微镜和流式细胞仪可观察检测到凋亡细胞的形态，发现EGCG进入患者体内48h后会诱导HeLa细胞凋亡,药物浓度越高，HeLa细胞凋亡率也会随之上升[11，12 ]。另外，在细胞凋亡过程中，Caspase家族激活具有重要作用，是导致肿瘤细胞凋亡直接因素。目前，临床研究中发现的Caspase家族已达到10余种以上，包括在细胞凋亡中起关键作用的Caspase-3。本研究通过对宫颈癌 HeLa 细胞进行体外培养，并采取MTT法对其检测发现，EGCG可对细胞增殖产生明显的抑制作用，且时间和剂量不同，其抑制效果表现也不一，DNA倍体通过流式细胞仪进行分析得出，EGCG作用48h，10mg/L、20mg/L、40mg/L浓度不断加大，S期细胞减少情况表现越明显，细胞周期阻滞效果明显优于G1期。由于肿瘤细胞还具有转移和浸润性特征，通过细胞划痕法进行检验发现，EGCG对细胞转移同样具有抑制作用，经过EGCG作用后，在划痕区肿瘤细胞基底膜穿过能力明显下降，且数量出现减少情况。