Klotho蛋白在UUO大鼠肾组织中的表达①

聂 晶，梅 梅，杨占双，杨 松

(佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154003)

肾脏纤维化(RIF)是一种病理生理改变，是肾脏的功能由健康到损伤，再到损坏，直至功能丧失的渐进过程，病理特点是以细胞外基质(ECM)的异常沉积。根据肾脏固有细胞受损害程度，以及是否还可以被修复，将肾脏纤维化的过程分为纤维化形成与进展的可逆阶段和瘢痕形成阶段，目前动物实验的研究集中在第一阶段。研究表明，在多种因素(药物中毒、高血压、糖尿病、慢性肾病等)作用下，肾脏固有细胞受到损伤发生功能改变，释放一系列致肾毒性的细胞因子，导致肾间质纤维化，其中TGF-β1∕Smad3作为至纤维化的共同通路，在RIF中发挥重要作用[1]。Klotho是TGF-β1∕Smad3通路的上游基因，与衰老有关。Klotho蛋白在肾远端小管中高表达[2]。有研究显示，klotho蛋白参与肾间质纤维化[3]，但具体作用机制不详尽。因此，本研究通过建立大鼠肾脏纤维化模型，观察病变肾组织中Klotho蛋白的表达，进一步明确其至RIF的机制，可能为寻求延缓肾间质纤维化进展提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料、动物

兔抗大鼠Klotho多克隆抗体，MASSON染色试剂盒，DAB试剂盒， SABC免疫组化试剂盒。健康清洁Wistar 42d龄雄性大鼠48只(由佳木斯大学动物实验中心提供)。

1.2 方法

1.2.1 实验分组及动物模型制作

将48只Wistar雄性大鼠饲养一周后随机分为两组，即正常组24只，UUO组24只。UUO组在无菌条件下行左侧输尿管结扎：术前称重，以10%水合氯醛0.4mL/100g腹腔注射麻醉，术区备皮，常规消毒，逐层进腹后，暴露肾脏，游离输尿管，在其近端及远端结扎，中间离断，头孢甲肟生理盐水腹腔冲洗，确保无出血及漏尿后逐层缝合。正常组仅做输尿管游离，不结扎。

1.2.2 标本收集、整理和测定

各组大鼠分别于术后第 3d、7d、14d处死，处死前内眦静脉采血3mL，离心后行血尿素氮和肌酐检测，处死后留取左肾组织，常规进行脱水、石蜡包埋、切边(3μm厚)，行HE染色，MASSON染色和免疫组化染色。

1.2.3 HE染色和MASSON染色

石蜡切片进行HE染色和MASSON染色，观察肾小管间质损伤情况和肾纤维化程度。HE染色在400倍光镜下，观察肾间质炎性细胞变化。MASSON染色，参考文献[4],在400倍光镜下，每张标本随机选取10个不含肾小球的视野以绿染纤维(即阳性面积)与整个视野总面积的比值作为肾间质纤维化指数(RIF)。

1.2.4 免疫组化染色

石蜡切片进行免疫组化染色，在400倍光镜下观察klotho蛋白表达情况，细胞质中出现棕黄色颗粒为阳性染色，分析计算两组肾组织阳性染色(棕黄色颗粒)的平均光密度(IOD)。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 血BUN及Cr分析

正常组3d、7d、14d血BUN、Scr未见明显异常与正常组相比，UUO组个时间点血 BUN、Scr明显升高，且随着梗阻时间逐渐加重。

2.2 HE染色结果分析

正常组的各时间点肾脏病理未见改变，UUO组随着时间的推移，肾间质炎性细胞浸润逐渐增多，受累肾小管出现先扩张，至第7天扩张明显，后逐渐萎缩，肾组织出现纤维化。见图1～4。

图1 正常组肾组织(HE×400)

图2 UUO组第3天肾组织(HE×400)

图3 UUO组第7天肾组织(HE×400)

图4 UUO组第14天肾组织(HE×400)

2.3 MOSSON染色分析

Masson 染色显示对照组各时间点肾脏病理结构未见改变，UUO组随梗阻时间延长，坏死程度逐渐加重，绿染的面积增大，RIF指数增加，差异有统计学意义 (P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠肾组织MOSSON染色RIF值

2.4 Klotho蛋白免疫组化分析

正常组各时间点肾小管上皮细胞的细胞质中可见一定量的棕黄色颗粒；与对照组相比，UUO组对应时间点肾组织中棕黄色颗粒减少，且随梗阻时间延长，棕黄色颗粒减少越明显，梗阻14d的肾组织细胞质中几乎无棕黄色颗粒表达，差异有统计学意义(P<0．05)，证明在正常大鼠肾组织中有Klotho蛋白表达，随着肾间质纤维化程度的加重，Klotho表达逐渐减少。见表2。

表2 各组大鼠肾组织Klotho蛋白表达情况

3 讨论

Klotho蛋白作为单向跨膜蛋白，具有调节钙磷作用，参与调控细胞凋亡和衰老等[5]；主要在肾小管上皮细胞中表达，可在血液及尿液中检查到。近年来相继有研究报道，Klotho在多种急、慢性肾脏疾病中发挥肾脏保护作用[6]。有文献报道，Klotho蛋白是通过调节VEGF的表达，减轻肾间质纤维化。如果Klotho基因的缺乏将导致肾脏更容易受到缺氧及药物所致的损伤[7，8]。近年来，有学者研究表明，Klotho蛋白可以抑制TGF-β1通路诱导的UUO大鼠肾脏纤维化[9]。本实验通过建立UUO大鼠模型，分析Sham组、UUO两组大鼠Klotho蛋白表达发现，UUO组大鼠随梗阻时间的延长，检测出Klotho蛋白的表达量呈下降趋势，肾间质纤维化程度亦逐渐加重，Sham组对应时间点Klotho蛋白表达未见明显改变，因此经本实验研究论证Klotho蛋白在肾脏纤维化中发挥重要的功能保护作用。研究[10]表明：慢性肾脏病(CKD) 早期，血清中 Klotho 蛋白的水平便开始下降，与GFR的下降趋势呈正比，这种变化显然先于血肌酐、血尿素氮等指标的变化，并具有一定特异性。李莎莎[11]等通过对 130 例 CKD 患者随访发现肾功能显著降低的患者，可表现出Klotho水平大幅度下降，提示Klotho蛋白水平随肾功能的降低而下降。因此，Klotho蛋白不仅在肾脏保护方面发挥重要作用，还有望成为有CKD早期诊断的生物标志物。