血浆外泌体源性lncRNAH19和lncRNAMALAT1与膀胱癌的相关性研究①

王 彤，李 升，黄立娟

(1.佳木斯大学附属第一医院,黑龙江 佳木斯 154003;2.哈尔滨医科大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150081)

膀胱癌(BC)是全球最常见的恶性肿瘤之一。当前，尿液细胞学检查缺乏排除癌症所必需的诊断敏感性，膀胱镜病理活检是诊断膀胱癌的金标准，但具有侵入性且价格昂贵，患者接受度低。 因此，需要新的标记物来帮助无创检测和监测膀胱癌[1，2]。外泌体是一种小的膜性囊泡，在肿瘤的发生发展过程中起着重要的作用，且由于外泌体含量相对稳定，研究已经应用于基因治疗。 因此，寻找外泌体中的标志物可以提高对于膀胱癌的早期筛查、早期诊断和早期治疗。有证据表明，lncRNA通过表观遗传调控、DNA损伤和细胞周期调控、对microRNA的调控[3，4]参与信号转导通路和介导激素等方式参与肿瘤的发生和发展。有报道显示，很多异常的lncRNA可以成为癌症诊断和预后的潜在生物标志物。本研究通过qRT-PCR分析lncRNAH19和 lncRNAMALAT1在外泌体中的表达水平，探讨其与膀胱癌患者临床病理参数的相关性及其对于膀胱癌的诊断价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2017-10～2019-05在哈尔滨医科大学附属第二医院首次确诊50例膀胱癌患者标本及50例健康对照组标本。标本采集须符合以下标准：(1)膀胱癌患者组采集静脉血前均未经手术、放疗及化疗等任何处理，且除膀胱癌外无其他类型肿瘤存在。(2)同时收集健康体检者血样50例，健康体检者查体显示无任何肿瘤相关疾病。(3)临床资料齐全。所有样本采集前均经哈尔滨医科大学附属第二医院伦理委员会批准，获得患者同意并签署知情同意书。

1.2 实验方法

EDTA抗凝管采集两组研究对象的静脉血，分别编号予以区别。4℃，3000g离心15min，上层的透明黄色液体即为血浆，利用超速离心法提取外泌体。利用外泌体RNA提取试剂盒(Exosome RNA Extraction Kit)提取总RNA，用电脑NanoDrop3330分光光度计对RNA进行检测，检测其浓度。用MonScript RTIII All-in-One Mix将RNA反转录为cDNA；lncRNAH19的上游引物：ACTCCAGAGCAAGCGTGTCATTC,下游引物：CTGCCTGGGGAGGGACACATG，lncRNAMALAT1上游引物：GACTACAGAGCCCCGAATTAATAC，下游引物：CATTTTCGTCTGCGTTTAGTAAATG,β-actin上游引物：ACCGAGCGCGGCTACAG：，下游引物： CTTAATGTCACGCACGATTTCC。引物均由上海生物科技有限公司合成。实时荧光定量PCR检测，设置为95℃30s,95℃10s,60℃30s,40个循环。lncRNAH19、lncRNAMALAT1均以β-actin为内参，用计算lncRNAH19、lncRNAMALAT1的相对表达量。

1.3 统计学方法

采用SPSS25.0统计软件分析，两组比较采用独立样本t检验;定量数据采用四中位数[M(P25,P75)]，将膀胱癌血浆外泌体lncRNAH19和lncRNAMALAT1的相对表达量与相应的临床病理参数进行统计分析；ROC受试者工作特征曲线评价lncRNAH19、lncRNAMALAT1对于膀胱癌的诊断价值。

2 结果

2.1 血浆外泌体中lncRNAH19、MALAT1的表达水平

lncRNAH19、MALAT1在膀胱癌组外泌体中的表达水平明显高于对照组(P<0.05)，见表1。

2.2 血浆外泌体lncRNAH19、MALAT1的表达水平与临床病理参数的相关性

lncRNAH19、MALAT1在外泌体中的表达与其临床病理参数无明显相关性(P>0.05)。见表2。

2.3 血浆外泌体中lncRNAH19、MALAT1对膀胱癌的诊断价值

ROC曲线分析评估lncRNAH19、MALAT1对膀胱癌的诊断价值：lncRNAH19、MALAT1的曲线下面积(AUC)分别为0.971，0.878，lncRNAH19特异性为72%，敏感度为98%；lncRNAMALAT1特异性为84%，敏感度为92%。lncRNAH19、lncRNAMALAT1联合诊断的曲线下面积(AUC)为0.994，特异性为94%，敏感度为96%。见表3，图1。

表1 血浆外泌体中lncRNAH19、MALAT1的表达水平

表2 膀胱癌患者血浆外泌体LncRNAMALAT1的表达水平与临床病理参数的相关性

表3 lncRNAH19、lncRNAMALAT1作为生物标志物对于膀胱癌的联合诊断价值

图1 血浆外泌体lncRNAH19与lncRNAMALAT1联合ROC受试者工作曲线

3 讨论

膀胱癌(BC)作为全世界泌尿系统最常见的恶性肿瘤[5]，其复发率很高。据报道，lncrna与膀胱癌的发生发展密切相关。研究表明，许多异常的lncRNA可以成为新的非侵袭性的生物标志物，用于不同肿瘤的诊断和预后。来自外泌体的lncRNA已在多种体液中被检测到。虽然核糖核酸酶存在于血液中，但由于外泌体和微泡的保护，lncRNA仍然是稳定的。因此，来自外泌体的lncRNA具有良好的肿瘤诊断前景。本研究初步探讨了膀胱癌患者血浆外泌体中lncRNAH19、lncRNAMALAT1的表达水平及其对于膀胱癌的诊断价值，为膀胱癌的诊断提供理论依据。

长期以来，人们一直认为膀胱癌中的lncRNAH19表达可用作早期复发的预后标志物[6，7]。Liu等人证实lncRNAH19的mir-675通过诱导G1阻滞和抑制细胞凋亡来促进膀胱癌细胞的增殖，这可能与mir-675对抑癌基因p53[8]的负调控有关。此外，最近的研究表明，lncRNAH19是从多种癌症中释放出来的，并且在患者的血清中可以作为一种稳定的形式被检测到，这种形式可以防止内源性RNase的侵袭。已经证实lncRNAMALAT1在膀胱癌中的表达较邻近正常组织表达上调，并在转移后较无转移的原发肿瘤有明显升高。因此，循环血中的lncRNAH19、lncRNAMALAT1有希望成为新的生物标志物[9]，用于癌症的早期检测或预后。

本研究通过qRT-PCR比较lncRNAH19、lncRNAMALAT1在膀胱癌组和健康对照组中的表达水平。结果发现，lncRNAH19、lncRNAMALAT1在膀胱癌患者中的表达水平明显高于健康对照组[10](P<0.05)，此外，我们还评估了两种lncRNA的表达水平与其临床病理参数的相关性，发现并无统计学意义(P>0.05)。最后我们绘制了ROC曲线，用来评价两种lncRNA分子对于诊断膀胱癌的敏感度和特异性：lncRNAH19、lncRNAMALAT1的曲线下面积(AUC)分别为0.971，0.878，lncRNAH19特异性为72%，敏感度为98%；lncRNAMALAT1特异性为84%，敏感度为92%。lncRNAH19、lncRNAMALAT1联合诊断[11]的曲线下面积(AUC)为0.994，特异性为94%，敏感度为96%。这些研究都为体液研究成为诊断膀胱癌的方式开辟了新的途径。

但我们的研究仍然存在一定的局限性，样本量相对有限，且由于时间限制，科研经费短缺及设备紧张，有些实验仍未进行。本研究只选择了健康对照组，并未加入良性病变组，若要应用于临床还需要扩大样本数量，不排除其他未知因素对膀胱癌诊断的特异性和诊断性的影响,还需要进一步扩大研究对象进行研究。