骨髓单个核细胞移植对溃疡性结肠炎小鼠miR-155表达的影响①

张 赫，鲍秀琦，韩宇鹏，韩桂华，陈 曦，布 琼，戚亚男

(佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯154003)

溃疡性结肠炎(UC)是一种病因不明的结肠和直肠慢性非特异性炎症性疾病。miR-155是一种内源性非编码小RNA。多个实验表明miR-155参与免疫细胞的生殖、分化，并调控慢性溃疡性结肠炎的发展[1]。前期实验[2]表明骨BM-MNCs移植对小鼠UC模型具有一定的修复作用。本研究旨通过复制BM-MNCs移植过程，对肠道组织中miR-155表达的研究以期更清晰认识BM-MNCs移植对UC的作用机制。

1 材料和方法

1.1 动物

清洁级 KM 小鼠72只，雄性，重量29～31g。动物合格证号： No. 211002300051893，辽宁长生，许可证号：SCXK(疗)2015-0001。

1.2 药物与试剂

小鼠骨髓淋巴细胞分离液(天津灏洋)；DSS(美国MP公司)；PBS泡腾片(武汉博士德)；水合氯醛(山东普惠分化学科技有限公司)；动物组织miRNA提取试剂盒(成都福际)；cDNA第一链合成试剂盒(上海罗氏)。

1.3 仪器

PCR热循环仪，美国应用生物系统公司；高速冷冻离心机，美国贝克曼库尔特有限公司；电泳仪，上海伯乐医学生命医学产品有限公司。

1.4 分组与UC模型制备

72只小鼠随机取54只，称重并记录数据，随机分为三组，分别为：正常对照组、UC模型组和BM-MNCs移植组，每组小鼠18只；余18只小鼠正常喂养用于提取BM-MNCs。正常对照组：常规喂养不做特殊处理；UC模型组与BM-MNCs移植组：采用2.5%DSS溶液替代饮水自由饮用7d，饲料正常喂养。

1.5 小鼠一般情况的观察和UC活动指数评估

采用Steidler等[3]的DAI评分标准每日对实验动物进行评分。

1.6 骨髓单个核细胞(BM-MNCs)的提取

健康KM小鼠用10%水合氯醛腹腔注射处死，放入75%酒精浸泡消毒 3min。无菌剥取双侧胫骨、股骨，剪去骨两端，用小鼠淋巴细胞冲洗液反复冲洗骨髓腔至骨髓腔变白，得到骨髓细胞悬液，余操作严格按试剂说明书逐一进行，全程操作均需在无菌及相同环境条件下进行，最终得到BM-MNCs。

1.7 BM-MNCs移植

造模成功后12h内，将移植组小鼠用固定器固定，暴露尾静脉，将染色后的BM-MNCs悬液经小鼠尾静脉注入(细胞含量约为3.2×106个/0.4mL)；UC模型组与正常对照组每只小鼠尾静脉注入0.4mL PBS。

1.8 组织标本处理

移植成功后，同等条件下对三组小鼠全部进行正常喂养，继续记录小鼠的饮水进食、活动情况、精神状态、体重及大便性状。移植成功后第5天，将全部小鼠水合氯醛麻醉处死，取其结肠组织，PBS冲洗，将结肠切成1cm每段。移植组随机取3只小鼠部分新鲜组织做快速冰冻切片(10μm)，电子荧光显微镜下观察BM-MNCs定植情况。4%中性甲醛固定24h，制备蜡块，HE染色，光学显微镜下观察组织形态学变化。

1.9 结肠组织miR-155的检测

采集新鲜的结肠组织30mg，经液氮冰冻后磨碎匀浆，按试剂说明书操作提取总RNA。分光光度计测定RNA浓度，使用罗氏cDNA第一链合成试剂盒进行反转录合成cDNA，在应用荧光定量PCR试剂盒，PCR仪扩增miR-155， U6为内参，反应条件：94℃预变性5min，然后94℃10s、50℃20s、72℃30s，35个循环，72℃7min、4℃冷却。采用2^-ΔΔCT法分析比较miR-155在三组间的表达情况。见表1。

表1 引物序列

1.10 统计学方法

2 结果

2.1 小鼠DAI评分

正常对照组小鼠 DAI 评分从始至终都为0分。UC模型组与BM-MNCs移植组在喂养DSS 3d后DAI评分逐渐增加，自移植成功后起，UC模型组DAI评分继续升高，而BM-MNCs移植组升高不明显。移植后第5天BM-MNCs移植组评分较UC模型组明显降低，差异均具有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 3组小鼠DAI评分分)

2.2 各组结肠组织病理学光镜下比较

光学显微镜下观察病理切片。正常对照组小鼠结肠黏膜组织完整，无破溃，无炎症细胞浸润，腺体结构正常。UC模型组结肠组织可见大量中性粒细胞浸润，隐窝组织高度破坏、腺体变形，部分黏膜下层血管扩张；而BM-MNCs移植组炎症细胞浸润相对较少，隐窝组织部分破坏，结构相对完整，炎症程度有所改善。见图1。

图1 正常组、UC模型组、BM-MNCs移植组(×200)

2.3 结肠组织miR-155表达情况

对各组小鼠结肠组织进行rT-PCR检测，结果显示，UC模型组明显高于正常对照组与BM-MNCs移植组，BM-MNCs移植组中miR-155表达略高于正常对照组，而明显低于UC模型组，见表3。

表3 3组miR-155表达情况比较

3 讨论

溃疡性结肠炎(UC)是一种长期慢性疾病，其重症UC有预后差、长期疗效不佳、易复发等特点，随着整体生活水平的提高，我国UC的发病率逐年上升，传统治疗手段已不能满足现代人的医疗需求。UC的发病机制至今未完全明确，现人们认为由多种因素相互作用造成的结果，包括环境、遗传、肠道微生物和免疫等因素，部分学者认为肠黏膜由于遗传、环境等各种因素导致其免疫系统异常激活是其重要的发病机制之一[4]。

BM-MNCs是干细胞成员之一，主要包括内皮祖细胞、造血干细胞和间充质干细胞等混合细胞成分。其具有很高的增殖能力，多向分化潜能，天然低免疫原性，使其可移植可能性大大增高，外国学者研究BM-MNCs移植对慢性UC修复作用具有长期稳定的效果[5]。国内对骨髓单个细胞的研究逐渐加深，有实验表明，BM-MNCs移植能通过下调COX-2、IL-1β的表达抑制脑梗死后的炎症反应，改善大鼠神经功能[6]；也有研究表明BM-MNCs移植能重建小鼠造血系统[7]。近年来，干细胞移植技术及修复方法逐渐发展，部分学者已应用于临床试验，5例UC自体干细胞移植治疗缓解率100%，随访3～14个月无复发，取得良好疗效及长期稳定的治疗效果[8]，为UC的临床治疗提供依据。

MicroRNA(miRNA) 是一类长度18～22个核苷酸组成的内源性非编码小RNA。miRNA也可以调控下游炎症因子的分泌及释放，影响机体的免疫系统，参与各种炎症反应[9]。国内已有临床实验，25例UC患者外周血和直肠黏膜组织中的miR-155均呈高表达，并与疾病的炎症程度呈正相关[10]。也有动物实验表明miR-155过量表达可激活Th17表达，并促进IL-6、IL-17、IL-23等炎症因子的释放，从而参与并加重UC的发生、发展[11]，均表明miR-155与UC的发病、进展呈正相关。Li等[12]的研究发现miR-155的降低能导致促炎性的巨噬细胞M1型转换成抗炎细胞巨噬细胞M2型，进一步抑制Th17细胞表达，以减少炎症因子的表达。

本实验应用DSS喂养建立UC模型，提取并移植BM-MNCs，移植后第5天，移植组较UC组DAI评分明显降低，取其结肠组织光学显微镜下见移植组炎症细胞较少、破坏程度降低，较UC模型组整体炎症变轻。应用rT-PCR检测其肠道组织中miR-155的表达，移植组均明显低于UC模型组，差异具有统计学意义(P<0.05)，证明了BM-MNCs移植能有效的改善UC的炎症反应，通过BM-MNCs移植其miR-155的表达较UC模型组明显降低，考虑BM-MNCs移植可能通过降低miR-155的表达以减少炎症的发生、发展，为临床治疗提供思路。