酸枣仁提取物通过调节Gi/o蛋白表达抑制cAMP-PKA通路促进小鼠骨骼增长的研究①

吴晓龙，谢 艳，邹吉锋，李少侠，薛彩霞，宁桃丽，王 娜

(河南省洛阳正骨医院(河南省骨科医院)，河南 洛阳 471000)

人的高矮普遍被关注。而矮小身材常伴有体力差弱或智商低下等身体不良素质。许多国家都很重视本国人民的身高，例如白俄罗斯将身材高挑的美女列为国家“战略资源”[1],而日本更是通过每日一包奶提高中小学生身高发育。生长激素是促进人体长高的第一要素，其主要在睡眠，尤其是慢波睡眠(SWS)期间分泌[2]。多数儿童在慢波睡眠期间分泌每日总量的50%～70%[3]。我们的前期实验发现，酸枣仁皂苷A可以促进慢波睡眠的延长，其机制是引起脑组织5-羟色胺1A受体(5-HT1AR)表达上调，同时生长激素分泌旺盛，小鼠体长较对照组增长[4],此次我们发现脑组织Gi/o蛋白表达上调，而且我们的实验发现药物可以引起脑组织AC(腺苷酸环化酶)、cAMP(环磷酸腺苷)及PKA(蛋白激酶A)含量下降，这一切暗示药物的作用途径可能与cAMP-PKA通路相关。基于此，本文探讨酸枣仁提取物通过调控Gi/o蛋白表达抑制cAMP-PKA通路促进小鼠骨骼增长的作用机制，为其他有类似作用的药物寻求作用靶点并提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

健康昆明种小鼠32只，SPF级，雄性，体重15～17g，动物许可证号SCXK(豫)2015-0001。动物饲养环境温度20～24℃，湿度50%～70%，12h明暗交替，光照7：00～19:00，噪音<50dB。

1.2 药物与试剂

酸枣仁皂苷A(中国食品药品检定研究院，批号A0274)，纯度>98%。酸枣仁提取物(陕西斯诺特生物技术有限公司)。小鼠生长激素(GH)ELISA试剂盒(上海纪宁实业有限公司，批号201511)；小鼠5-羟色胺(5-HT)ELISA试剂盒(上海纪宁实业有限公司，批号201510)；磷酸酶抑制剂蛋白浓度测定试剂盒(Servicebio公司，货号G2026)；TEMED (Amresco公司，货号Amresc00761)；蛋白marker(Therm 公司，货号26616)；PVDF膜(Millipore，货号IPVH00010)；兔多抗GAPDH(杭州贤至生物有限公司，AB-P-R 001)；兔多抗5-HT1AR(Bioss公司，货号Bs-1124r)；HRP标记山羊抗兔(Servicebio公司，货号GB23303)。

1.3 主要仪器

酶标仪(Labsystems Multiskan MS，芬兰，352型)；双垂直电泳仪(北京六一仪器厂，型号DYCZ-24DN)；转印电泳仪(北京六一仪器厂，型号DYCZ-40D)；脱色摇床(Servicebio公司，型号TSY-B)；冷冻离心机(heal force公司，型号neofuge 13R)；掌上离心机(Servicebio公司，型号D1008E)。

1.4 方法

1.4.1 动物分组

来自同一天出生的8窝小鼠，4只/窝，随机分为4组，分别是空白对照组、用药组(酸枣仁提取物组)、阳性对照组(酸枣仁皂苷A组)、Gi/O蛋白选择性抑制剂组，每组8只，保证同一窝4只小鼠随机分在不同的组，以去除遗传的影响。用药组灌胃酸枣仁提取物水溶液，按照0.320mg/g体重灌胃；阳性对照组灌胃酸枣仁皂苷A水溶液，药物用纯净水溶解，按照0.013mg/g体重灌胃；Gi/O蛋白选择性抑制剂组也灌胃酸枣仁提取物水溶液，方法同上，并于末次灌胃后侧脑室注射百日咳毒素(PTX)0.4μg/只。

1.4.2 药物对小鼠发育期体长的影响

4组小鼠原始体长不存在统计学差异(P>0.05)。小鼠适应环境1周后开始进行灌胃操作，1次/日，灌胃后第20天分别麻醉动物，测量小鼠体长，从头部最顶端到小鼠臀尾交接处即为小鼠体长，数据精确到1mm。

1.4.3 测定小鼠血中生长激素GH的含量

各组小鼠在测定体长后麻醉状态下进行眼眶取血，在室温下待血液自然凝固20min后，以离心半径3 000r/min离心20min，收集上清液，采用ELISA试剂盒测定GH含量。

1.4.4 Gi/O蛋白蛋白质印迹法(westernblot)检测小鼠脑组织

眼眶取血后的小鼠立即脱颈椎处死，将一半脑组织称重，RIPA充分裂解提取蛋白。将等量的2×SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)蛋白上样缓冲液加入到收集的蛋白样品中，用沸水浴加热10min，使蛋白变性。等待样品冷却到室温后，将蛋白样品上样加入到SDS-PAGE胶加样孔内，15μL/孔。浓缩胶电压为80V，跑胶0.5h；分离胶电压为120V，时间1.5h。将预先裁好的滤纸和PVDE在甲醇中浸泡3min，然后浸入转膜缓冲液中浸泡5min。将转膜装置放置好，进行转膜。转膜结束后，把蛋白膜立即放置到Western洗涤液中进行漂洗，时间为5min。随后加入5%脱脂奶粉，在摇床上缓慢摇动1h，进行封闭。按照一抗、二抗说明书进行操作。TBST洗涤液进行洗涤，10min每次，×3次。显影、定影，冲洗胶片。用BandScan分析胶片灰度值。

1.4.5小鼠脑组织AC活性、cAMP、PKA含量的检测

剩余的一半脑组织加入PBS中冰浴条件下匀浆，离心，取上清液，按照ELISA试剂盒操作说明进行脑组织AC活性、cAMP、PKA含量检测。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 药物对小鼠体长的影响

灌胃20d后阳性对照组、用药组小鼠体长明显大于空白对照组，存在明显统计学差异(P<0.05)；用药组和阳性对照组比较，存在统计学差异(P>0.05)。抑制剂组与用药组结果相当。见表1。

表1 药物对小鼠体长的影响

2.2 Gi/o蛋白western blot检测结果

小鼠脑组织Gi/o蛋白western blot结果显示，用药组和阳性对照组明显比空白对照组含量高。证明药物可以增加脑组织内Gi/o蛋白含量。而其抑制剂组Gi/o蛋白含量并不降低，因为蛋白抑制剂主要是通过抑制其受体表达从而抑制Gi/o蛋白所影响的信号通路的。

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图1 Gi/o蛋白western blot 检测结果

注：1.空白对照组 2. 阳性对照组 3. 用药组 4. Gi/o 蛋白抑制剂组

2.3 药物对小鼠血清生长激素含量的影响

由于溶血，每组8个样本中各丢失了几个样本。用药组血清生长激素含量在数值上明显高于其他组，特别是空白对照组，但差别不具备统计学意义。见表2。

表2 药物对小鼠血清生长激素含量的影响

2.4 药物对小鼠脑组织AC活性、cAMP含量、PKA含量的影响

用药组和阳性对照组脑组织AC活性明显低于空白对照组，而Gi/o蛋白抑制剂组与空白对照组相当，明显高于用药组；用药组和阳性对照组脑组织cAMP含量均较空白对照组有所降低，存在明显统计学差异(P<0.01)，Gi/o蛋白抑制剂可以抑制这一现象，含量与空白对照组相当；药物引起小鼠脑组织PKA活性降低，与空白对照组比较(P<0.01)，数值上显示用药组PKA活性较阳性对照组高，但是无统计学差异。而Gi/o蛋白抑制剂可以逆转这一现象。见表3。

表3 药物对小鼠脑组织AC活性、cAMP含量、PKA含量的影响

3 讨论

本实验首先验证了酸枣仁提取物促进小鼠体长增长的作用，说明酸枣仁提取物可以明显增加生长发育期小鼠的体长。由于侧脑室注射Gi/o蛋白抑制剂会引起动物瘫痪，所以我们只是在第20天灌胃后进行了一次侧脑室注射，由于之前与用药组一样灌胃了20d药物，所以体长与用药组无统计学差异。用药组血清生长激素含量虽然在数值上高于其他各组，但是无统计学差异，这可能是由于我们以往都是给药后30min检测血中生长激素含量，而此次，我们为了尽快取脑组织检测其他指标，在给药20min后就采血检测了血清生长激素含量，可能药效还没达到峰值。实验中检测生长激素含量时，因为眼眶采血有时会由于血液碰到周围毛发及胡须而溶血，故脱落了几例数据。实验发现，酸枣仁提取物可以引起Gi/o蛋白高表达，降低脑组织AC活性，再引起cAMP含量下降，使得PKA含量下降，与我们前期实验相结合，发现这一系列现象会引起脑组织5-HT1AR高表达，从而引发慢波睡眠，引起生长激素含量升高最终引起动物体长增长[5]。

cAMP-PKA属细胞经典途径之一，其过程为G蛋白偶联受体将信号首先传至AC,控制cAMP的含量，PKA的活性由cAMP所决定，PKA负责受体，离子通道，转录因子等很多蛋白的磷酸化，调节细胞内的生物活性反应及平衡。G蛋白发挥主要介导机制的是Gα亚基，根据偶联的性质，可以分为Gs、Gi/o和Gq。Gs为兴奋性偶联，可以激活下游偶联的腺苷酸环化酶(AC)，使细胞内第二信使cAMP浓度升高，继而激活PKA-CREB等通路。Gi/o为抑制性偶联，抑制AC活性，导致cAMP浓度下降。Gq偶联磷脂酶PLCβ，结果导致DG和IP3增多，继而激活PKC，下游底物被磷酸化后，信号得到级联放大。因此，我们的实验证明药物引起了Gi/o蛋白的高表达，引起抑制cAMP-PKA途径，引发觉醒减少，从而睡眠，特别是慢波睡眠增加引起动物身高增高的，这与报道相符[6]。

由于目前没有市售的促进慢波睡眠的成药和中草药及单体成分。既往研究[7]发现酸枣仁皂苷A的具有促进慢波睡眠和生长激素分泌作用。文中所用药物为酸枣仁提取物，其总皂苷含量为5%，而酸枣仁提取物中具有促进睡眠的作用主要是皂苷A和皂苷D，而且研究表明皂苷A作用更好[8]。文中实验中酸枣仁提取物的用量是将酸枣仁提取物折合成酸枣仁皂苷A的含量。而实验发现其促进小鼠增高作用与酸枣仁皂苷A相当。由于提取物比单体成分价格低廉，这就大大降低了以后临床使用的成本。本实验进一步验证了其作用通路，为今后研究药物通过促进慢波睡眠促进骨骼增高提供了研究思路，为以Gi/o蛋白、cAMP-PKA通路上如cAMP、AC、PKA为靶点的促进慢波睡眠的药物研究提供了研究基础。