肉豆蔻醚抑制结肠癌细胞增殖、迁移和侵袭的作用及机制研究＊

段春燕，何娜娜，朱 蕾，范 磊，伊 凡，王 婷，邓皖利

（1. 新疆医科大学附属中医医院 乌鲁木齐 830016；2. 新疆昌吉州中医医院 昌吉 831100；3. 青岛西海岸新区中心医院 青岛 266555；4. 乌鲁木齐市中医医院 乌鲁木齐 830000；5. 上海中医药大学附属曙光医院 上海 200120）

结直肠癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，高居肿瘤相关死亡率第二位，结直肠癌在国内外的发病率仍持续上升[1-2]。随着早期诊断和治疗手段的发展和改进，结直肠癌的切除率和生存率有所提高，整体中位生存期现已延长至30个月[3-4]。化疗是中晚期结直肠癌、术后患者甚至术前的重要治疗手段，但迄今为止的化疗方案均未达到预期效果[5]，寻找探索新型化疗药物对于改善结肠癌预后具有重要意义。近年来，研究证明可食植物肉豆蔻具有抗癌的药理作用，肉豆蔻中提取的肉豆蔻醚（myristicin）是发挥抗肿瘤作用的重要有效活性成分[6-7]。有研究显示，肉豆蔻醚可以抑制多种恶性肿瘤如肺癌[8]、神经母细胞瘤[9]等生长。本课题以结肠癌HCT116 和LOVO 细胞株为实验对象，检测肉豆蔻醚对HCT116 和LOVO 细胞增殖、迁移和侵袭的影响，并初步探讨其中分子机制。

1 材料与方法

1.1 细胞

研究的细胞为人结肠癌HCT116 和LOVO 细胞，购自于中国科学院上海细胞研究所。

1.2 药物

所用的药物为肉豆蔻醚（百灵威科技有限公司，货号：607-91-0）。

1.3 主要试剂和仪器

主要试剂和仪器为：1640 细胞培养基（上海源培生物有限公司，货号：L220）；胎牛血清（Thermo Fisher-USA，货号：10100147）；0.25%胰蛋白酶（上海源培生物有限公司，货号：S330JV）；青链霉素混合液（Thermo Fisher-USA，货号：15070063）；MTT（Sangon Biotech-Shanghai，货号：298-93-1）；DMSO（Sigma-USA，货号：D5879）；EDTA(100X)（BBI Life Sciences，货 号：E673003-0100）；1M Tris pH7.4（Beyotime，货 号：ST788）；30% Acr/Bis（Beyotime，货号：ST003，）；APS（生工生物工程股份有限公司，货号：7727-54-0）TEMED（上海歌凡生物科技有限公司，货号：WB012）；蛋白Marker（Thermo Fisher Scientific，货号：26616）；a-Tublin 抗体（上海拓然生物科技有限公司，货号：66031-1-lg）；ERK 抗体（CST，货号：4696）；p-ERK 抗体（Santa Cruz，货号：sc-7383）；CyclinD1（上海拓然生物科技有限公司，货号：60186-1-lg）；p-MEK1/2（CST，货号：166F8）；MEK1/2（CST，货号：9122）；E-cadherin（Abcam，货号：ab1416）；MMP-2（CST，货号：4022）；MMP-9（CST，货号：3852）；发光液（爱必信生物科技有限公司，货号：abs921）；多聚甲醛（上海润捷化学试剂有限公司，货号：30525-89-4）；结晶紫（生工生物工程股份有限公司，货号：548-62-9）；Transwell 小室（BD，货号：353097）；Annexin V/PI 检测试剂盒（BBI Life Science，货 号：E606336-0100）；流 式 细 胞 仪（BD Bioscience，货号：FACS Calibur）；电泳仪（北京六一生物科技有限公司，货号：DYCZ-25E）；转膜仪（北京六一生物科技有限公司，货号：DYCZ-40G）；倒置显微镜（重庆光学仪器厂，货号：XDS-1）；酶标仪（深圳雷杜生命科学股份有限公司，货号：RT-6100）。

1.4 细胞培养

人结肠癌HCT116 和LOVO 细胞为贴壁细胞，采用含10%新生牛血清、1%青链霉素混合液的RPMI-1640培养基培养于37℃、5%CO2饱和湿度下常规培养传代，待细胞密度达到90%左右时，对细胞进行传代处理，将处于对数生长期的细胞用来做后续实验。

1.5 MTT实验检测细胞增殖情况

将对数生长期的HCT116 和LOVO 细胞以5000 cells/well 的密度接种于96 孔培养板中，每孔接种体积为0.1 mL。待细胞贴壁后，将不同浓度的肉豆蔻醚（2.5 μg/mL，5 μg/mL，10 μg/mL，20 μg/mL，40 μg/mL和80 μg/mL）加入对应的孔中，每个用药浓度设置6个复孔，空白对照组加等体积的配药溶剂。将细胞置于37℃，5% CO2的培养箱中继续培养48 h，向每孔加入20 μL 的5 mg/mL MTT，继续培养4 小时。培养结束后，小心吸弃上清，每孔加入100 μL DMSO 溶解MTT的还原产物甲瓒，震动混匀数秒，用酶标仪检测，以570 nm 为参照波长测定其吸光度。计算肿瘤细胞的存活率，利用Graph Pad prism 软件计算细胞的半数抑制浓度（IC50）。半数抑制浓度（IC50）代表细胞存活率达到一半时的药物作用浓度。

1.6 Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡

将HCT116 和LOVO 细胞消化计数，以每孔2 ×105cell/well 的密度接种于6 孔板，设置不同的肉豆蔻醚浓度（0 μg/mL、2 μg/mL、5 μg/mL），分别加入对应的孔板中，药物处理48h，收集细胞，PBS 重悬清洗细胞2次，用1 × binding buffer 将细胞浓度调整为1 × 105个/mL。取100 μl 的细胞悬液至各个EP 管中，加入5 μL Annexin V-FITC、5 μL 的PI 进行染色，充分混匀后，室温避光孵育15 min，加入400 μL 1 × binding buffer，上机检测药物作用后细胞凋亡的改变。按照流式细胞仪的说明操作仪器进行检测。检测结果中四个象限代表的意义分别是：左下象限：正常活细胞群；右下象限：处于早期凋亡的细胞群；右上象限：处于晚期凋亡的细胞群；左上象限：坏死的细胞群。

1.7 划痕实验检测细胞迁移情况

在6 孔板背面用marker 笔沿直尺画直线，使直线穿过整个孔，以上述方法每孔穿过4条线，每条线之间间 隔0.5 mm。将2 μg/mL、5 μg/mL 处 理48 h 的HCT116 和LOVO 细胞接种于6 孔板。镜下观察细胞划痕，并用Leica QwinV3软件测量划痕距离，根据划痕距离计算细胞的迁移率。细胞迁移的距离公式：（Oh划痕宽度减去24 h 划痕宽度）/2。移行距离抑制率定义为:（d对照组减去d用药组）/d对照组×100%。

1.8 Transwell实验检测细胞侵袭情况

提前一天将Matrigel 从-20℃冰箱取出，在4℃冰上过夜冻融。实验中所需的枪头，移液管及EP 管提前一天在4℃进行预冷。用无血清培养基1640 将Matrigel以1：3比例进行稀释，混匀后铺于Transwell小室上层。待接种细胞用无血清的培养基稀释配制，加入已铺胶的Transwell 小室内，待细胞贴壁后，加入配好 的 不 同 浓 度 的 肉 豆 蔻 醚（2 μg/mL、5 μg/mL）。Transwell 小室的下层加入400 μL 含5% FBS 的培养基。然后将细胞于37℃，5% CO2培养箱中培养24 h。将Transwell 上室内的培养液弃掉，用棉签轻柔的擦拭小室膜的上层，去除未迁移的细胞及Matrigel 基质胶。接下来用4%甲醛固定细胞，进行结晶紫染色，室温放置15 min。用蒸馏水轻柔的洗Transwell 小室3-5 次，洗去染色剂。镜下观察并计数穿过Matrigel 膜的细胞数量，细胞侵袭率计算公式为：（1-实验组侵袭细胞数/对照组侵袭细胞数）×100%。

图1 MTT检测肉豆蔻醚对结肠癌细胞HCT116和LOVO增殖的影响

图2 检测肉豆蔻醚对HCT116和LOVO细胞迁移和侵袭能力的影响

图3 流式细胞术检测肉豆蔻醚对HCT116和LOVO细胞凋亡的影响

1.9 Western blot

采 用Western blot 实 验 检 测MEK1/2、ERK1/2、CyclinD1、E-cadherin、MMP-2 以及MMP-9 表达水平变化。在0 μg/mL、2 μg/mL、5 μg/mL 肉豆蔻醚作用48 h后，消化收集细胞，采用细胞总蛋白提取试剂盒提取细胞总蛋白，采用Bradford 法检测蛋白含量。然后将蛋白样品在95°C 水浴中变性并与上样缓冲液混合加到SDS-PAGE 胶上，每个孔蛋白上样量保持一致。随后陆续进行电泳、转膜、封闭、一抗孵育、二抗孵育、ECL发光、显影、定影。

1.10 数据统计

文中数据均采用统计软件SPSS 进行统计分析。所有数据均以平均数± 标准差（± s）表示。t检验（ttest）和单因素方差分析（One-way ANOVA）用于推测统计。P＜0.05 代表数据具有统计学差异。每个实验均设置三次重复。

2 结果与分析

图4 WB实验检测肉豆蔻醚对MEK/ERK信号通路相关蛋白的影响

2.1 肉豆蔻醚在体外抑制HCT116和LOVO细胞增殖

MTT 结果显示肉豆蔻醚作用HCT116 和LOVO 细胞48 h 后，各浓度组对细胞增殖均有抑制作用，与对照组比较均有差异（P＜0.05），并且肉豆蔻醚对细胞增殖的抑制作用呈显著的剂量依赖性（图1A、B）。根据抑制率计算药物作用后的IC50值分别为23.68、21.17。

2.2 肉豆蔻醚抑制结肠癌细胞HCT116 和LOVO 的迁移和侵袭

划痕实验的结果显示，肉豆蔻醚作用HCT116 和LOVO 细胞48 h 后，能够抑制细胞的迁移。随着药物浓度的增加，抑制细胞迁移作用增强（图2A）。

Transwell 实验结果显示，肉豆蔻醚作用结肠癌细胞48 h 后，能有效抑制细胞的侵袭。随着药物浓度的增加，穿过Matrigel 凝胶到达小室下层的细胞数逐渐减少，对侵袭作用的抑制能力逐渐增强（图2B）。

2.3 肉豆蔻醚诱导HCT116和LOVO细胞凋亡

Annexin V/PI 双染法结果显示，当肉豆蔻醚作用HCT116和LOVO细胞48 h后，活细胞数目百分比由多变少；凋亡细胞数目百分比由少变多，说明肉豆蔻醚对HCT116 和LOVO 细胞具有凋亡诱导作用，并且该诱导作用具有浓度依赖性（图3 A和B）。

2.4 肉豆蔻醚调控MEK/ERK信号通路表达

当肉豆蔻醚作用HCT116 和LOVO 细胞48 h 后，经Western blot 法 检 测 细 胞 中MEK1/2、ERK1/2、CyclinD1、E-cadherin、MMP-2 以及MMP-9 表达水平变化。结果显示，肉豆蔻醚能升高细胞中E-cad表达，能降低细胞中p-MEK1/2、p-ERK1/2、CyclinD1、MMP-2、MMP-9表达（图4）。

3 讨论

中医药在治疗肿瘤中发挥着十分重要的作用，并且在抑制肿瘤的增殖方面也占据关键地位。中医治疗从整体而论，扶正与祛邪并重。放疗与化疗主要是对肿瘤的抑制作用，以攻为主。但中医的治疗中正邪兼顾，虚则补之，实则泻之，攻补兼施。不但兼顾了患者因疾病导致的虚，同时也对肿瘤部位进行攻伐，两者相得益彰[10-11]。近年来，对中医药抗肿瘤的研究越来越多，许杜娟等[12]研究表明黄芪提取物可以增强荷瘤小鼠的免疫力、抑制细胞的生长，从而加强小鼠的抗肿瘤能力。李建军等[13]研究灵芝多糖对荷瘤小鼠的影响，发现灵芝多糖干预后的小鼠T细胞明显升高，说明灵芝多糖可以增强小鼠免疫力、抑制肿瘤的生长。中医在肿瘤治疗中极具特色，现代医学机制与中医理论相结合，从现代研究中阐述中医药抗肿瘤的机理，对于肿瘤的防治有重要的意义。

肉豆蔻属于肉豆蔻科，早在《本草纲目》卷十四《草部·肉豆落》中对其释名：“（寇）宗爽曰：肉豆落对草豆落为名。去壳只用肉。其形圆小，皮紫紧薄，中肉辛辣。”性温味辛。具有理脾燥湿，行气调中，涩肠止泻，温中行气的作用。入脾、胃、大肠经，能够起到温中、下气、消食、固肠等作用。常被用于治疗心腹胀痛、虚泻冷痢、呕吐、宿食不消等症。肉豆蔻中的主要成分为挥发油、脂肪油、苯丙素和木脂素等。肉豆蔻醚是采用乙醇提取的主要成分，被认为具有抗癌活性[14]。研究显示，肉豆蔻醚作用于荷瘤小鼠后，可抑制肿瘤的生长，并能有效的提高小鼠免疫力，提示肉豆蔻通过增强荷瘤小鼠的免疫功从而达到抗肿瘤的效果[15]。

ERK是MAPK家族中重要的成员之一[16]。ERK家族共有5个亚族，包括ERK1～ERK5，在ERK 家族中研究最广泛的是ERK1和ERK2，这两个分子广泛表达在多种细胞中，参与细胞内很多生理过程的调节[17]。在正常生理状态下，ERK1/ERK2 通路对肠上皮细胞增生、分化中具有促进作用，并且能够抑制肠上皮细胞的凋亡；当机体出现异常时，比如肿瘤的发生，氧化应激等，这些均会刺激细胞膜上的受体酪氨酸激酶（Ras），Ras 进一步激活丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（Raf蛋白激酶），活化的Raf-1 蛋白酶可以与MEK1、MEK2结合，使MEK1、MEK2 发生磷酸化，磷酸化的MEK 再激活下游的ERK1/2，使其磷酸化，即ERK 的活性形式，后者进入细胞核，作用于各种转录因子，诱导基下游因表达[18]。该通路发生异常活化预示着肿瘤细胞的生物学性质较为活跃，肿瘤细胞增殖速度加快，较易发生侵袭和转移，对化疗、放疗的敏感性降低，患者生存时间缩短等[19]。MEK/ERK 信号通路在调控细胞周期和凋亡中起着重要作用，其中CyclinD1 是细胞周期中的调节因子，当MEK/ERK 信号通路被激活后，CyclinD1表达水平升高，加快了细胞周期的进程，抑制细胞凋亡。在本研究中，肉豆蔻醚能够明显下调结肠癌细胞中p-MEK1/2、p-ERK1/2、CyclinD1 表达水平。提示肉豆蔻醚可能通过调控MEK/ERK 信号通路诱导结肠癌细胞发生凋亡。

肿瘤侵袭转移是由多环节构成，层层递进，涉及多步骤、多方面。其中上皮间质转化（EMT）是始动环节。EMT 主要参与生物胚胎发育、器官纤维化以及肿瘤侵袭和转移[20]。EMT的发生与肿瘤细胞的侵袭能力的改变有相关性。EMT最显著的特征之一就是E-cad表达水平的降低，E-cad 具有维持细胞间粘附的功能，其表达水平的降低或缺失会降低细胞间黏附，导致肿瘤细胞的扩散，且易于发生侵袭与转移[21]。基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinases，MMPs），是一种能够降解细胞基底膜的蛋白酶，具有促进肿瘤细胞的侵袭和转移的作用[22]。当肿瘤发生侵袭转移时，常伴有Ecad表达降低而MMP-2，MMP-9表达升高[23]。因此，上调E-cad表达或下调MMP-2，MMP-9表达可抑制结肠癌的迁移侵袭。本实验采用western blot 方法检测肉豆蔻醚对细胞E-cad、MMP-2、MMP-9 表达的影响。结果显示肉豆蔻醚能够上调HCT116 细胞E-cad 表达，同时能够下调MMP-2、MMP-9 的表达。以上结果表明肉豆蔻醚可能通过调控EMT 来抑制结肠癌侵袭转移。

综上所述，本研究证实肉豆蔻醚可显著抑制结肠癌HCT116 和LOVO 细胞增殖、迁移侵袭，进而诱导细胞凋亡。并且初步说明肉豆蔻醚可能通过调控MEK/ERK 信号通路以及EMT过程而发挥以上的抗癌活性。本研究结果为临床用药提供一定的实验依据，为肿瘤治疗提供新的靶点和策略。