基于网络药理学探讨乳香
——没药药对干预乳腺增生症的分子机制＊

葛安琪，杨凯麟，刘丽芳，曾柳庭，范洪桥

（1. 湖南中医药大学第一附属医院 长沙 410007；2. 湖南中医药大学 长沙 410208）

乳腺增生症（Hyperplasia of Mammary Gland,HMG）的临床症状主要表现为周期性的乳腺胀痛，经期来临前和情绪郁结时加重[1-2]，占比乳腺疾病的三分之二以上，是中青年女性最常见的乳腺疾病，育龄妇女发病率中约占50%。快生活节奏导致发病人数逐年攀升[2-4]，我国育龄期妇女的检出率为15%-22%[5]。尽管乳腺增生症的发展与乳腺癌仍然缺少关联性证据，但乳腺癌的患者常常合并乳腺增生，随着时间的推移，乳腺增生症发展成乳腺癌的可能性也越来越大[6-8]。目前较为公认的发病机制主要与内分泌功能紊乱密切相关。该病症的健康管理主要包括心理治疗、西药治疗、手术治疗、中医中药治疗等[9-10]，但长期口服药物治疗会产生机体激素水平紊乱和各种用药不适，加剧乳腺增生的程度[11]。中医中药治疗是目前临床效果和使用最常见的管理策略，中药内服在治疗乳腺增生症取得了良好的效果，并且由于经济、安全、无副作用己被广大患者接受[12-13]。

王春晖通过对中国知网和万方数据库进行检索，总结治疗乳腺增生病的中药外治法用药规律发现：乳腺增生病中药外治法中使用频次最高的3 味药是乳香、没药、冰片；“乳香和没药”“乳香和冰片”等则是最常用的药对[14]。更多的临床研究发现，西黄丸治疗乳腺增生具有较好的疗效[15-17]，且乳香-没药药对是西黄丸的主要构成[18]。乳香、没药同为活血化瘀类中药，乳香性温，没药性平，二者皆味辛、苦，气芳香，入心、肝、脾经，具有活血散瘀、消肿止痛功效，两者作为经典的活血化瘀药在乳腺增生的治疗中经常出现，发挥了良好的效果，但其作用机制仍然不清楚。网络药理学为本研究提供了新的工具，其主要基于系统生物学、计算机生物学，透过网络的构建以及网络拓扑学的属性对药物的靶点进行探索[19-26]。无论是疾病发生发展还是药物研发，以往的模式采用的是还原论的研究方法，但是临床上的多种疾病往往都具有多靶点交叉作用的疾病，针对单一的靶点往往无法达到治疗的目的，且带来了众多的副作用和低的治疗依从性，乳腺增生症作为一种复杂的内分泌的疾病，通过网络药理学的工具也将是最佳探索中药复方对乳腺增生的工具。本文试图通过网络药理学方法解释乳香-没药药对治疗乳腺增生症的分子机理。.

1 材料与方法

1.1 活性成分化合物的筛选

乳香-没药药对的化合物从TCM@Taiwan 数据库[27-31]、Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology（TCMSP）数据库[27-30,32]和TCMID 数据库（https://academic.oup.com/nar/article/41/D1/D1089/1057998）[25]中选取。为避免遗漏，还结合了乳香-没药药对相关实验研究[33-35]。中草药中的活性成分的组合构成了治疗疾病的物质作用基础，同时多组分的成分中大部分药物通过吸收入血才能保持有效的作用成分，从而发挥生理作用，因此，通过中药活性组分吸收、利用、代谢的药代动力学原理以及多成分多结构的特性，本研究采用了生物利用度（OB）、Caco-2 渗透性和类药性（DL）这三个参数来对中草药化合物进行筛选[36-37]。具体的筛选数值，满足OB＞30%，Caco-2＞-0.4 和DL＞0.18则被认为是符合规定的、可通过口服吸收的、具有药理活性的化合物[36-37]。

1.2 潜在作用靶点反向预测

从SciFinder、TCMSP 数据库上获得目标化合物的化学结构，利用Pubchem 数据库以及其他化学结构数据库转换成各活性成分有效成分的SMILES 式，将SMILES式输入Swiss Target Prediction 数据库进行靶点预测。Swiss 数据库是一个在线预测生物活性小分子的大分子靶标（来自人类、小鼠、大鼠的蛋白质）的工具，包含了来自三个不同物种的超过3000种蛋白质的370000 已知活性物质[38-39]。与此同时，由于药物靶点可能存在命名不规范等问题，本研究使用UniProtKB搜索注释功能，并且将物种限定为智人，以确保有效的筛选作用于人类的靶点，同时也可以将其校正为蛋白的官方名称（Official Symbol）以更加精确的为下面的网络构建和分析做准备，通过以上数据库的检索和转化操作，得到活性成分靶向的蛋白靶点[26]。

1.3 靶点构建的网络的通路注释分析

对获取的蛋白靶点信息，通过DAVID 数据库进行KEGG 通路注释分析。将乳香-没药药对靶向的生物网络靶蛋白（基因）直接注释到信号通路，药物靶点富集的通路被认为是药物调控的信号通路[26,40]。

1.4 乳香-没药药对生物网络靶点的构建

通过对乳香-没药药对已知靶点的搜集、潜在靶点预测以及富集分析的结果，采用生物信息学可视化软件Cytoscape 3.4.0 构建活性成分-预测靶点网络模型和成分-靶点-通路验证网络模型[24]。在构建的网络分析中，活性成分、靶点或者作用通路通过节点（node）来展现等。节点之间则以边（edge）相连，根据所构建网络的不同，边代表的意义也不同[26,41]。

2 结果

2.1 乳香-没药药对有效成分-预测靶点网络

利用Swiss Target Prediction 所预测的靶点构建“乳香-没药药对有效成分-预测靶点”网络，该网络包含271个节点（220个预测靶点和51个有效成分）和769个边。通过该网络可发现，一些预测靶点仅被少量有效成分调控，而另一些预测靶点可以被较多的有效成分所调控。例如，雄激素受体（AR）、ESR1（雌激素受体1）、ESR2（雌激素受体2）可被至少15个有效成分所调控，而F2（凝血酶原）、周期蛋白依赖性激酶1（CDK1）等仅被少部分有效成分调控。有些有效成分共同调控一些靶点，例如，ESR1、ESR2 均可被豆甾醇（Stigmasterol）、二氢黄柏甙（Phellamurin）、矮牵牛苷（Petunidin）、天 竺 葵 素（Pelargonidin）、没药醇C（Myrrhanol C）、曼苏宾-13（17）-烯-3,16-二 酮（Mansumbin-13(17) -en-3, 16-dione）、异氟奎酮（Isofouquierone）、胍甾酮（Guggulsterone）、4,17（20）-（顺 式）- 孕 二 烯-3, 16-二酮（4, 17(20) - (cis) -pregnadiene-3,16-dione）、3β-乙酰氧基-16β，20(R)-二羟 基 达 玛 -24- 烯（3β -acetoxy-16β, 20(R) -dihydroxydammar-24-ene ）、16-hydroperoxymansumbin-13(17)-en-3β-ol、11α-羟基孕甾-4,17（20）-反式二烯-3,16-二酮（11α-hydroxypregna-4,17(20)-transdiene-3,16-dione）、（8R）-3-氧代-8-羟基-多倍体-13E，17E，21-三烯（(8R)-3-oxo-8-hydroxy-polypoda-13E,17E,21-triene）、（20s）-3β，12β，16β，25-五羟基达玛-23-烯（(20S)-3β,12β,16β,25-pentahydroxydammar-23-ene）、甘遂醇（Tirucallol）所调控（见图1、表1、表2）。这体现了中药多组分-多靶点的特性。

图1 乳香-没药药对有效成分-预测靶点网络

2.2 乳香-没药药对信号通路-预测靶点-单味药网络

通过对预测靶点KEGG 通路富集分析，共返回60条信号通路，其中与治疗乳腺增生症相关的信号通路6 条，通过富集度的高低分别是类固醇激素生物合成、雄激素和雌激素代谢、血管内皮细胞生长因子（VEGF）信号通路、ErbB 信号通路、mTOR 信号通路、类固醇生物合成。将富集后的信号通路数据构建“乳香-没药药对的单味药-预测靶点信号通路-网络”。在该网络中，乳香调控15个预测靶点，没药调控35个预测靶点，提示没药在该药对治疗乳腺增生症的过程中发挥主要作用（见图2）。在该网络中，每个信号通路所富集到的预测靶点各有不同（见图3），反映了有效成分对靶点及信号通路的调节各有侧重。信号通路的详细信息展示于表3。在表3中，信号通路P值代表富集程度，为EASE 评分，是修正的Fisher精确P值，P值越小富集程度越高。

表1 各有效成分调节靶点数目

表2 有效成分调控的预测靶点（前20）

图2 乳香-没药药对信号通路-预测靶点-单味药网络

表3 信号通路详细信息

图3 各通路所包含靶点数目

2.3 乳香-没药生物过程-预测靶点-单味药网络

通过预测靶点的GO富集分析，共返回497个生物过程，其中与治疗乳腺增生症相关的生物过程有14条，通过富集度的高低分别为类固醇代谢过程、对激素刺激的反应、类固醇生物合成过程、对类固醇激素刺激的反应、甾醇代谢过程、调节激素水平、激素代谢过程、对雌激素刺激的反应、雌激素代谢过程、甾醇生物合成过程、对皮质类固醇刺激的反应、类固醇激素受体信号通路、对雌二醇刺激的反应、雌激素生物合成过程。根据所获得的生物过程数据，构建“乳香-没药生物过程-预测靶点-单味药网络”，乳香调控60个预测靶点，没药调控18个预测靶点，提示没药在该药对治疗乳腺增生症的过程中发挥主要作用（见图4）。在该网络中，每个生物过程所富集到的预测靶点各有不同（见图5），反映了有效成分对生物过程的调节各有侧重。生物过程详细信息展示见表4，提示乳香-没药药对通过其有效成分作用于不同的分子靶点群，进而调控乳腺增生症相关的生物过程。

3 讨论

在乳香-没药药对靶向乳腺增生症的这些生物过程和信号通路中，网络分析的结果显示，生物过程和信号通路都与卵巢功能的失调有关，例如，其中具体的调控靶点如：雄激素受体（AR）、ESR1（雌激素受体1）、ESR2（雌激素受体2）等可被药对中的至少15个有效成分调控。这显示了乳香-没药药对干预乳腺增生症发生发展的病理机制，尤其是作为治疗乳腺增生症中药复方中的核心药对发挥作用的具体机制。最近的实验研究也证实了该结果，Hao 等发现乳香和没药可靶向雌激素受体α（ERα），其通过促进ERα和HSP90 的解离，导致ERα的降解和阻断ERα向细胞核的转运，以此来阻断雌激素的作用；乳香和没药还通过与HSP90 结合引起ERα和其他癌蛋白的解离[42]。对单一成分的研究也证实，胍甾酮（guggulsterone）对类固醇激素受体具有较高的亲和力，并可作用于它们从而发挥相应效果，包括雄激素（AR）、糖皮质激素（GR）和孕酮受体（PGR）、雌激素受体（ESR）[43]。柑桔素（naringenin）联 合 他 莫 昔 芬 可 以 下 调ERα66 和GPR30的表达，而且上调ERβ和ERα36[44]。

目前，已知正常的乳腺发育中，雌激素和孕激素共同促进乳腺导管，小叶以及腺泡的发育[45-46]。当卵巢功能调节失常时以及下丘脑-性腺轴失常时，雌激素升高，孕激素降低，雌孕比例升高，进而使得乳腺组织增生在一个完整的月经周期内出现病理性的增生，从而导致乳腺导管上皮和周围纤维组织增生，增生的乳腺末梢和乳管腺泡形成囊肿，出现乳腺增生症[47-48]。此外，催乳素同样是导致乳腺增生的重要因素[49]。一方面高水平的催乳素与乳腺上皮细胞表面的催乳素受体结合，改变细胞膜的功能；另一方面，催乳素可进入细胞内于核受体结合从而导致后续的一系列转录和合成，增加乳腺腺泡和导管的增生[49]。流行病学的调查结果显示，乳腺增生症患者催乳素水平异常增高，通过中西医结合的综合管理可以降低催乳素含量，改善治疗乳腺增生症[50]。因此，催乳素水平的增高与乳腺增生也存在密切关系。随机对照试验的结果也显示补充乳香、甜菜碱和肌醇可减少年轻女性纤维腺瘤的大小[51-52]。

图4 乳香-没药药对治疗乳腺增生症的对应靶点

图5 各生物过程所包含靶点数目

在乳腺增生症中雌激素及其介导的信号通路显示，雌激素通过两条途径共同促进乳腺细胞的发育[53]，一方面，E2与ER形成的激素受体复合物促使ER成为独立的二聚体结构，导致E2 和细胞DNA 的亲和力增加，进而促进下游的一系列转录和相关蛋白的表达，促进乳腺细胞的增殖[54]；另一方面，E2 与乳腺细胞膜上G 蛋白偶联受体(GPER)结合，通过第二信使系统激发MAPK 级联反应并激活ERK/c-fos 途径，进而促进乳腺细胞的增殖[53-54]。已知PI3K/AKT 信号通路具有促进乳腺细胞增殖、抑制凋亡以及血管生成等功能，其功能通过影响其下游的多种效应分子而实现[55-56]。曼苏宾酸具有强力消炎作用，约为传统非甾体类药物吲哚美辛（消炎痛）的50 倍[57]。通过对乳香-没药药对的靶点的信号通路富集显示：类固醇激素生物合成，雄激素和雌激素代谢，VEGF 信号通路，ErbB 信号通路，mTOR 信号通路，类固醇生物合成，这些都显示了乳香-没药药对通过调控乳腺细胞增殖、炎性反应、血管生成、细胞凋亡和自噬等信号传导通路发挥抑制乳腺增生的作用。目前，实验研究显示，主要活性成分来自乳香没药的西黄丸能调节激素及受体表达水平，增强抗氧化能力和免疫功能，改善增生病理组织，具有抗乳腺增生作用[58-60]。基于实验研究可推测，乳香-没药药对中的有效成分成分胍甾酮（guggulsterone）、柑桔素（naringenin）等可能通过调节类固醇激素受体（ESR、PGR、AR、GR）及其他靶点，进而调控类固醇相关信号通路和生物过程（mTOR 信号通路、类固醇生物合成、对雌激素刺激的反应、雌激素代谢过程、甾醇生物合成过程、对皮质类固醇刺激的反应）及其他生物过程，从而发挥抑制乳腺增生的作用[42-44]。

表4 生物过程详细信息

综上所述，乳香-没药药对抑制乳腺增生的活性成分主要有甘遂醇、扁枝杉烯、乳香脂酸、因香酚、α-乳香酸、乙酰-α-乳香酸、β榄香酮酸、没药甾酮、没药甾醇VI、没药甾醇IV、没药醇C、3-甲氧基呋喃-9-烯、2-甲氧基呋喃-9-烯-8-酮、16S,20R-二羟基达玛-24-烯-3-酮、豆甾醇、槲皮素、曼苏宾酸、曼苏宾13-17-烯-3,16 二酮、15α-羟基曼苏宾酮、异氟奎酮、淫羊藿醇、木脂素、菠菜甾醇、卡巴拉酮、卡巴雌二醇乙酸酯、β-谷甾醇、7β，15β-二羟基孕甾-4-烯-3,16-二酮、4,17（20）-顺式-孕二烯-3,16-二酮等51个；涉及作用靶点271个，其中前20个分别是：雄激素受体、细胞色素P45019A1、微管相关tau 蛋白、雌激素受体α、雌激素受体β、钠依赖性去甲肾上腺素转运蛋白、类固醇17α-羟化酶/17,20 裂解酶、糖皮质激素受体、盐皮质激素受体、钠依赖性多巴胺转运蛋白、钠依赖性血清素转运体、酪氨酸蛋白磷酸酶非受体2 型、1 型酪氨酸蛋白磷酸酶非受体、酪氨酸DNA 磷酸二酯酶1、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A 还原酶、钠和氯依赖性甘氨酸转运体1、钠和氯依赖性甘氨酸转运体2、皮质类固醇11β脱氢酶同工酶1、大麻素受体1、羟类固醇11β脱氢酶1样蛋白。这些靶点在乳腺增生调控中主要涉及类固醇激素生物合成、雄激素和雌激素代谢、VEGF 信号通路、ErbB 信号通路、mTOR 信号通路、类固醇生物合成等六条信号传导通路，和类固醇代谢过程、对激素刺激的反应、类固醇生物合成过程、对类固醇激素刺激的反应、甾醇代谢过程、调节激素水平、激素代谢过程、对雌激素刺激的反应、雌激素代谢过程、甾醇生物合成过程、对皮质类固醇刺激的反应、类固醇激素受体信号通路、对雌二醇刺激的反应、雌激素生物合成等14条生物过程，其作用机制主要体现在抑制乳腺细胞增生、促进细胞凋亡自噬、抑制炎症反应和血管新生等方面。

大数据时代的到来，为中医药的研究提供了十分强大的方法学，对中医药现代化发展具有重要意义。中药作为中医临床实践的载体是中医学科发展的不可或缺的组成部分，尽管中药疗效已为几千年的历史和现代医疗实践所肯定，但明确中药科学内涵仍然是中医药发展的要求。现代化的中医药研究最初通过辩证用药等文本和文献的数据挖掘揭示临床用药治疗的一般规律，再从临床出发，通过应用现代化学、现代生物学方法提取分析发现有效成分，到如今大数据和人工智能进行进行海量资料分析整合，为阐明中药的作用机理、发现新的治疗药物、丰富中药理论提供了切实可行的实现路径。

本文通过对乳香-没药药对现代药理学的文献调研和利用计算机软件进行预测，利用cytoscape 3.4.0软件对传统理论与现代药理学关联性网络，化学成分-潜在靶点网络，单味药-潜在靶点-信号通路网络进行分析。再从整体、组织、细胞、分子四个水平对该药对的化学成分、作用靶点、作用通路三个方面所所筛选的多组分、多指标数据进行网络构建和分析，初步阐明了乳香-没药药对作用乳腺增生症的物质基础和作用机理。虽然通过网络药理学方法已经可以全面系统地展示乳香-没药药对中潜在活性成分的抗乳腺增生症的效果，但是这种方法不能直接反映化合物含量对预测靶点、信号通路和生物过程的影响等，这也是目前网络药理学方法的局限性。然而，这并不能否认网络药理学的重要意义，未来的研究可根据网络药理学预测结果针对性地对部分靶点、信号通路、生物过程等进行研究，从而节省时间和精力，有利于进行更加深入、系统地研究。

4 结论

本研究通过运用DL 评估、OB 预测、Caco-2 通透性的方法，获得了可能是乳香-没药药对的可口服吸收的和具有药理活性的成分，预测了潜在的作用靶点和乳腺增生症相关信号通路和生物过程，初步阐明了乳香-没药药对干预乳腺增生症的物质基础和作用机理。

4.1 乳香-没药药对抑制乳腺增生的主要活性成分

本研究初步明确了乳香-没药药对抑制乳腺增生的51个主要活性成分：甘遂醇、扁枝杉烯、乳香脂酸、因香酚、α-乳香酸、乙酰-α-乳香酸、β榄香酮酸、没药甾酮、没药甾醇VI、没药甾醇IV、没药醇C、3-甲氧基呋喃-9-烯、2-甲氧基呋喃-9-烯-8-酮、16S,20R-二羟基达玛-24-烯-3-酮、豆甾醇、槲皮素、曼苏宾酸、曼苏宾13-17-烯-3,16 二酮、15α-羟基曼苏宾酮、异氟奎酮、淫羊藿醇、木脂素、菠菜甾醇、卡巴拉酮、卡巴雌二醇乙酸酯、β-谷甾醇、7β，15β-二羟基孕甾-4-烯-3,16-二酮、4，17（20）-顺式-孕二烯-3，16-二酮等。

4.2 乳香-没药药对干预乳腺增生症的作用靶点

本研究初步明确了乳香-没药药对干预乳腺增生症的271个作用靶点，其中前20个分别是：雄激素受体、细胞色素P45019A1、微管相关tau 蛋白、雌激素受体α、雌激素受体β、钠依赖性去甲肾上腺素转运蛋白、类固醇17α-羟化酶/17,20 裂解酶、糖皮质激素受体、盐皮质激素受体、钠依赖性多巴胺转运蛋白、钠依赖性血清素转运体、酪氨酸蛋白磷酸酶非受体2 型、1 型酪氨酸蛋白磷酸酶非受体、酪氨酸DNA磷酸二酯酶1、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A 还原酶、钠和氯依赖性甘氨酸转运体1、钠和氯依赖性甘氨酸转运体2、皮质类固醇11β脱氢酶同工酶1、大麻素受体1、羟类固醇11β脱氢酶1样蛋白。

4.3 乳香-没药药对调控乳腺增生症的信号传导通路

本研究初步明确了乳香-没药药对调控乳腺增生症的6条信号传导通路：类固醇激素生物合成、雄激素和雌激素代谢、VEGF 信号通路、ErbB 信号通路、mTOR信号通路、类固醇生物合成。

4.4 乳香-没药药对调控乳腺增生症的生物过程

本研究初步明确了乳香-没药药对调控乳腺增生症的14个生物过程：类固醇代谢过程、对激素刺激的反应、类固醇生物合成过程、对类固醇激素刺激的反应、甾醇代谢过程、调节激素水平、激素代谢过程、对雌激素刺激的反应、雌激素代谢过程、甾醇生物合成过程、对皮质类固醇刺激的反应、类固醇激素受体信号通路、对雌二醇刺激的反应、雌激素生物合成。

4.5 乳香-没药药对干预乳腺增生症的作用机制

本研究初步阐明了乳香-没药药对干预乳腺增生症的作用机制主要体现在抑制乳腺细胞增生、促进细胞凋亡自噬、抑制炎症反应和血管新生等方面。