二冬膏对LPS诱导小鼠肺泡巨噬细胞分泌TNF-α、IL-6及AQP1的影响

董永强 夏雪竹△ 刘翠红 管 涛 陈占功

（1.北京中医医院，北京 100010；2.首都医科大学附属北京佑安医院，北京 100069；3.北京医院国家老年医学中心，北京 100730）

二冬膏是我国经典的滋阴养肺方，由天冬、麦冬组成，用于治疗肺阴不足引起的燥咳痰少、痰中带血、鼻干咽痛，具有抗炎、增强免疫等药理作用［1］。研究表明，二冬膏能够减轻急性肺损伤大鼠肺组织水肿，改善肺部病理炎症［2］。急性肺损伤是由各种直接或间接致伤因素导致的肺组织结构和功能的损伤，主要表现为大量中性粒细胞、巨噬细胞等炎性细胞浸润以及肺毛细血管内皮和肺泡上皮细胞屏障功能紊乱［3］。其中肺泡巨噬细胞是推动急性肺损伤病理进程的关键细胞，肺泡巨噬细胞的募集、活化是导致肺部炎性因子大量释放的重要诱导因素［4-5］。为了进一步研究二冬膏改善急性肺损伤肺部炎症的作用，本文以LPS诱导的肺泡巨噬细胞为对象，考察二冬膏含药血清对肺泡巨噬细胞中一氧化氮（NO）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）及白细胞介素-6（IL-6）的影响，并探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级SD大鼠40只，雌雄不拘，体质量180～220 g，购于北京华阜康生物科技股份有限公司，动物许可证号：SCXK（京）2014-0004。动物饲养于12 h光照和12 h黑暗光照周期的环境内，自由饮食饮水，饲养环境温度（24±2）℃。所有动物实验均符合动物伦理委员会标准。

1.2 试药与仪器 二冬膏按《中国药典》（2015年版）配方制备，由天冬和麦冬等比例组成，加水煎煮3次后合并煎液，过滤、浓缩后与炼蜜混合呈黄棕色浓稠煎膏剂，生药质量浓度为1.0 g/mL。天冬、麦冬均购于亳州中药材市场。RPMI-1640培养基、胎牛血清购于美国Gibco公司；脂多糖（LPS）、MTT［3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide］购于美国Sigma公司；TRIzon总RNA提取试剂购于北京康为世纪生物科技有限公司；iTaqTMUniversal SYBR Green supermix购于美国BIO-RAD公司；5×all in one RT-MasterMix购于上海斯信生物科技有限公司；NO测定试剂盒购于南京建成生物工程研究所；小鼠TNF-α和IL-6 ELISA试剂盒购于南京翼飞雪生物科技有限公司；一抗水通道蛋白1（AQP1）、Toll样受体4（TLR4）、髓样分化因子（MyD88）、核转录因子κB p65（NF-κB p65）、β肌动蛋白（β-actin）及二抗HRP标记羊抗兔IgG（H+L）购于沈阳万类生物科技有限公司。

1.3 细胞培养 将小鼠肺泡巨噬细胞MH-S细胞（美国ATCC）于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中培养，培养条件为37℃、5%CO2恒温培养箱。待细胞生长至对数生长期时，将细胞接种于96孔板或6孔板中继续培养。

1.4 含药血清制备 40只SD大鼠随机分为4组，每组10只：空白组、二冬膏低剂量组（2 g/kg）、二冬膏中剂量组（4 g/kg）、二冬膏高剂量组（8 g/kg）。大鼠适应性饲养1周后开始灌胃给药，每日2次，空白对照组给予10 mL/kg生理盐水。连续给药3 d后，在末次给药1 h后腹主动脉取血，每只大鼠采血量约为5 mL，血液室温下静置2 h后，于3 000 r/min下离心10 min，取同组上层血清混匀后即得二冬膏含药血清。

1.5 MH-S细胞活力检测 采用MTT法检测，取对数生长期的MH-S细胞制成5×104个/mL的细胞悬浮液，接种于96孔板中，每孔100 μL，随行设置空白对照孔（只含100 μL培养基）。6 h后，弃去培养基，每孔加入180 μL无血清培养基，调零孔每孔加入20 μL不含血清培养基，其余各孔分别加入20 μL含药血清，每组设置6个复孔。继续培养6、12、24 h后，弃去培养基，每孔加入MTT溶液（0.5 mg/mL）100 μL继续培养4 h后弃去上清液，每孔加入100 μL二甲基亚砜，充分溶解反应产物后，于490 nm处测定吸光度值，实验重复3次。

1.6 Western blotting法检测MH-S细胞中TLR4、MyD88、NF-κB p65及AQP-1蛋白表达 取对数生长期的MH-S细胞制成1×105个/mL的细胞悬浮液，接种于6孔板中，每孔2 mL。接种6 h后，弃去培养基，每孔加入1 800 μL无血清培养基，空白孔及模型孔加入空白组大鼠血清200 μL，其余孔分别加入二冬膏低、中、高剂量含药血清200 μL，模型组及二冬膏各剂量组每孔另加0.5 mg/mL的LPS溶液2 μL。另设一孔加入200 μL PBS作为阴性对照。继续培养24 h后，无菌管收集细胞培养上清进行细胞因子的检测。细胞用预冷的PBS洗涤2次后，每孔加入含1%蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液100～150 μL，裂解后将细胞小心刮下离心取上清，BCA法检测细胞蛋白的浓度。调整蛋白浓度，取相同总量的蛋白进行SDS-PAGE电泳、转膜。转膜后用4%脱脂牛奶室温封闭2 h，TBST清洗后加入一抗稀释液于4℃孵育过夜，TBST清洗后加入二抗稀释液室温孵育2 h，TBST清洗后进行化学发光、显影、定影。采用Image Pro-Plus 6.0软件分析电泳条带灰度值，以目的蛋白与β-actin灰度值的比值作为目的蛋白的相对表达量。

1.7 RT-PCR检测MH-S中TNF-α、IL-6及AQP-1 mRNA表达 按照上述方法进行MH-S细胞的接板、给药。给药24 h后，弃去上清液，用预冷的无菌PBS缓冲液洗涤2次，加入TRIzon总RNA提取试剂提取RNA。RNA逆转录参照逆转录试剂盒说明书将试剂混匀，放入逆转录仪器中进行转录。逆转录所得产物直接进行荧光定量PCR，参照试剂盒说明书在专用低位PCR反应孔板中加入相关反应物，引物序列见表1，参照试剂盒说明书进行反应。以β-actin为内参，所得结果将原始值进行2-ΔΔCt转换后进行统计学处理。

表1 引物序列

1.8 细胞上清液NO、TNF-α及IL-6含量的检测 按照相关试剂盒说明书操作，绘制标准曲线，分别计算各细胞因子的含量。

1.9 统计学处理 应用SPSS22.0统计软件。计量资料以（）表示，采用单因素方差分析对数据进行显著性检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组MH-S细胞存活率的比较 见表2。与空白组相比，二冬膏低、中、高剂量组在干预24 h内对MHS细胞的存活率没有明显影响（P＞0.05）。

表2 各组MH-S细胞存活率的比较（%，±s）

表2 各组MH-S细胞存活率的比较（%，±s）

组别n 6 h 12 h 24 h 3 3 3 3空白组二冬膏低剂量组二冬膏中剂量组二冬膏高剂量组100.00 101.73±1.22 98.03±2.67 97.07±1.89 100.00 98.37±3.06 100.67±3.56 98.13±3.27 100.00 99.33±2.14 96.07±3.30 97.63±2.49

2.2 各组MH-S细胞分泌炎性介质水平比较 见表3。与空白组相比，LPS刺激MH-S细胞24 h后，细胞培养上清液中NO、TNF-α及IL-6的含量明显升高（P＜0.01）。二冬膏能不同程度地降低MH-S细胞NO、TNF-α及IL-6的分泌量，并呈一定的剂量依赖关系，但各剂量间差异无统计学意义（P＞0.05）。

表3 各组MH-S细胞分泌NO、TNF-α及IL-6比较（±s）

表3 各组MH-S细胞分泌NO、TNF-α及IL-6比较（±s）

与模型组比较，∗P＜0.05，∗∗P＜0.01。下同

组 别n NO（μmol/L）TNF-α（μg/L）IL-6（μg/L）3 3 3 3 3空白组模型组二冬膏低剂量组二冬膏中剂量组二冬膏高剂量组5.67±1.72**35.07±6.75 25.50±2.90 18.20±2.84*12.23±1.40**65.63±7.11**232.43±40.89 183.33±13.84 146.60±12.73*99.07±8.30*32.57±4.52**156.20±25.60 103.77±9.76*82.17±12.09*71.93±5.26*

2.3 各组MH-S细胞中TNF-α、IL-6及AQP-1 mRNA的比较 见表4。与空白组相比，LPS刺激MH-S细胞24 h后，细胞中TNF-α和IL-6 mRNA表达量明显升高（P＜0.01），AQP-1的表达量明显下降（P＜0.01）。给予二冬膏含药血清后，MH-S细胞中TNF-α和IL-6 mRNA的表达量明显降低（P＜0.05或P＜0.01），而AQP-1 mRNA的表达量明显回升（P＜0.05或P＜0.01）。

表4 各组MH-S细胞中TNF-α、IL-6及AQP-1 mRNA的比较（±s）

表4 各组MH-S细胞中TNF-α、IL-6及AQP-1 mRNA的比较（±s）

组别空白组模型组二冬膏低剂量组二冬膏中剂量组二冬膏高剂量组n 3 3 3 3 3 TNF-α 1.06±0.06**2.12±0.10 1.81±0.08*1.52±0.14**1.28±0.11**IL-6 1.02±0.02**2.35±0.20 1.88±0.12*1.72±0.09*1.51±0.03**AQP-1 1.90±0.12**1.02±0.03 1.23±0.07*1.49±0.04**1.65±0.10**

2.4 各组MH-S细胞中TLR4、MyD88、NF-κB p65及AQP-1蛋白的比较 见图1，表5。与空白组相比，LPS刺激MH-S细胞24 h后，细胞中TLR4、MyD88及NF-κB p65蛋白水平明显升高（P＜0.01），AQP-1蛋白水平明显降低（P＜0.01）。给予二冬膏中剂量含药血清后，MH-S细胞中TLR4、MyD88及NF-κB p65蛋白水平明显下降（P＜0.05或P＜0.01），而AQP-1蛋白水平明显升高（P＜0.01）。

表5 各组MH-S细胞中TLR4、MyD88、NF-κB p65及AQP-1相对表达量的比较（±s）

表5 各组MH-S细胞中TLR4、MyD88、NF-κB p65及AQP-1相对表达量的比较（±s）

组别空白组模型组二冬膏中剂量组n 3 3 3 TLR4 0.25±0.07**1.12±0.10 0.48±0.11**MyD88 0.16±0.05**0.91±0.19 0.46±0.10*NF-κB p65 0.07±0.02**0.49±0.12 0.25±0.04*AQP1 0.82±0.22**0.08±0.02 0.37±0.08**

图1 各组MH-S细胞中TLR4、MyD88、NF-κB p65及AQP-1表达

3 讨 论

肺泡巨噬细胞是肺部巨噬细胞的主要组成部分，是肺组织抵御外部侵袭的第一道防线，在维持肺部免疫系统稳态过程中发挥着重要作用［6］。肺组织在受到外源性或内源性的致病因素刺激时，肺泡巨噬细胞会大量募集并分泌大量炎性介质，形成肺组织局部炎症微环境［7］。在炎性环境下，巨噬细胞表面的Toll样受体表达增加，激活下游相关通路，进一步促进炎性因子的分泌与释放。近年来研究发现，肺泡巨噬细胞参与急性肺损伤、慢性阻塞性肺病、支气管哮喘、肺纤维化等多种肺部疾病［8-12］，提示肺泡巨噬细胞在这些疾病的发生发展过程中扮演着重要的角色。

二冬膏最早载于《摄生秘剖》，是由天冬和麦冬等比例混合经水煎、浓缩与炼蜜混合的黄棕色稠厚煎膏剂，具有养阴润肺的功效，用于治疗肺阴不足引起的燥咳痰少、痰中带血、鼻干咽痛［13］。研究发现，二冬膏能够抑制肺肿瘤发生、肺癌细胞A549增殖、改善LPS诱导的大鼠急性肺损伤，减轻肺组织的炎性损伤［2，14-15］。NO主要由巨噬细胞中的一氧化氮合酶催化合成，NO的过度释放会造成周围正常细胞的损伤［16］。TNF-α和IL-6均为炎症反应中的重要细胞因子，TNF-α能够激活NF-κB和JNK信号通路，调节机体的炎症反应和免疫调节的过程；IL-6能够激活JAK2/STAT3信号通路，调节T细胞和B细胞的增生和分化，参与免疫调节，引起免疫性病理损伤［17］。本文考察二冬膏含药血清对LPS诱导小鼠肺泡巨噬细胞MH-S的影响，结果发现二冬膏含药血清能够明显抑制LPS诱导的巨噬细胞中NO、IL-6及TNF-α等炎性介质的分泌量，并能抑制IL-6及TNF-α mRNA的表达，提示二冬膏具有改善炎症反应的作用。

Toll样受体（TLRs）主要分布于动物体内的巨噬细胞、单核细胞及淋巴细胞等免疫细胞表面。TLRs能够直接识别并结合病原体或其产物，引发一系列信号转导，进而导致炎性介质的释放［18］。TLR4是人类发现的首个TLRs蛋白，其与相应配体结合后，能进一步激活NF-κB，从而促进各种炎性因子基因表达的激活。细胞表面的TLR4受体被激活后，能与MyD88蛋白的羧基端结合，进而激活NF-κB通路，诱导IL-6及TNF-α等炎性因子的表达［19］。AQP1在维持肺部液体平衡中起到重要作用，研究发现在LPS所致的急性肺损伤中，剧烈的炎症反应造成肺泡上皮细胞和血管内皮细胞受损使肺组织AQP1表达急剧下降。AQP1蛋白主要存在于上皮细胞和内皮细胞中，但巨噬细胞膜上AQP1的减少能够明显影响巨噬细胞的吞噬功能，加重炎症反应［20］。本文研究发现，二冬膏含药血清能够改善由LPS导致的AQP1的下调，同时抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路，进而抑制炎性因子的表达与释放。

综上所述，二冬膏含药血清能够通过上调AQP1，抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路，从而抑制炎性因子的表达及释放，达到抗炎作用。