响叶杨组培快繁技术研究

梁丽容，付 利，张国君，康伟静，宋国宝，肖 毅

(泰格林纸集团股份有限公司，湖南 岳阳 414002)

响叶杨属白杨派山杨类，是我国特有的树种，分布在我国南方10多个省(市、自治区)的海拔300～2500m山地。响叶杨对土壤要求不严格，对土壤酸碱度的适应性较强，黄壤、黄棕壤、沙壤土、冲积土、钙质土等酸性、微碱性土壤均能正常生长。响叶杨木材白色，心材微红，材质和强度都较一般黑杨要好，可供房屋建筑、家具，造纸等用材，是长江中下游海拔1000m以下山区土层深厚地方的重要造林树种[1-5]。

响叶杨种子极小，外壳薄，易飞散，且成熟时间不一，采集难度大，所育苗木遗传差异大，常规大田扦插繁殖又难以生根[6-8]，因此，组培快繁研究对响叶杨优良无性系在南方山地的推广有重要意义。响叶杨组培研究始于20世纪90年代，有学者先后对白杨、响叶杨的组培技术进行了研究[9-11]，研究表明，白杨再生的最适外植体为叶片，愈伤组织诱导最佳培养基为MS+0.10mg·L-16 — BA+0.10mg·L-1NAA，愈伤组织诱导率为34.8%；不定芽分化的最佳培养基为MS+0.30mg·L-16 — BA+0.06mg·L-1NAA，不定芽分化率为44.4%；对响叶杨×84K杨高效再生体系建立的研究表明，茎段和叶片不定芽诱导的最佳培养基为MS+0.0015mg·L-1TDZ+0.05mg·L-1NAA，茎段不定芽再生率可达91%，诱导不定芽生根的最佳组合为1/2 MS+0.01mg·L-1NAA+0.10mg·L-1IBA，生根率可达100%。相关研究侧重于培养基和植物生长调节剂的配比、筛选，实现离体再生目的，并未对响叶杨再生体系进行优化研究。以往研究成果，受制于外植体生存环境，工厂化快繁条件及操作人员水平，在实际生产应用中效果并不理想。

本文以响叶杨叶片为外植体，研究优化其再生体系，为响叶杨工厂化快速扩繁提供技术基础。

1 材料与方法

1.1 外植体的选择及预处理

外植体来源为湖南茂源林业有限责任公司从湖北十堰市竹溪县迷魂阵林场采摘回的响叶杨优树枝条，并将枝条上的芽苞嫁接到公司温室栽培的黑杨苗干上进行保存。3个月后将嫁接苗带根植株移栽到培育室内，每周用1000倍百菌清溶液喷洒植株，1个月后选取新发嫩叶做外植体。

1.2 试验设计与方法

1.2.1 外植体消毒 用无菌水将外植体反复冲洗，时间20min，然后用滤纸吸净后放置在干净的工作台上，使用0.10%升汞溶液进行消毒，消毒时间分别设计为4.5、5.5、6.5min，再用无菌水冲洗8次，最后用酒精焰火消毒后的无菌剪刀把伤口剪掉，在没有植物生长调节剂的基本培养基MS培养基环境中接种，每种处理接种60瓶，每瓶一个外植体，3次重复。经过10d的培养，统计不同消毒时间外植体存活数量。

1.2.2 愈伤组织及不定芽诱导 10d后，将无菌外植体转移到诱导愈伤组织及不定芽的培养基中，以MS为基本培养基，设计2种因素植物生长调节剂6 — BA(3种浓度水平分别为0.50、0.80、1.00mg·L-1)和NAA(3种浓度水平分别为0.10、0.15、0.20mg·L-1)的正交试验。试验共9种处理(见表1)，每种处理接种30瓶，每瓶接种4个外植体，重复3次。30d后按照同样的培养基转瓶培养一次，50d后统计外植体诱导情况。

表1 不定芽诱导试验因素及水平Tab.1 Factors and levels of adventitious bud induction (mg·L-1)处理6-BA浓度NAA浓度1—10.500.101—20.500.151—30.500.201—40.800.101—50.800.151—60.800.201—71.000.101—81.000.151—91.000.20

1.2.3 增殖培养 50d后将已诱导出不定芽的芽团转移到增殖培养基中培养，以MS为基本培养基，设计2种因素植物生长调节剂6-BA(3种浓度水平分别为0.20、0.30、0.40mg·L-1)和NAA(3种浓度水平分别为0.10、0.15、0.20mg·L-1)的正交试验。试验共9种处理(见表2)，每种处理接种30瓶，重复3次。30d后，对丛生芽生长情况进行观察和统计。

表2 不定芽增殖试验因素及水平Tab.2 Factors and levels of adventitious bud proliferation test (mg·L-1)处理6-BA浓度NAA浓度2—10.200.102—20.200.152—30.200.202—40.300.102—50.300.152—60.300.202—70.400.102—80.400.152—90.400.20

1.2.4 生根培养 30d后，在生根培养基中接入挑选合格的不定芽，不定芽要求高2～3cm且生长健壮。生根培养基以1/2 MS为培养基，采用植物生长调节剂NAA(4种浓度分别为0.05、0.10、0.15、0.20mg·L-1)进行处理，每种处理30瓶，重复3次。经过20d培养后，对根数、根长和生根率进行统计。

1.2.5 各阶段基本培养条件 以上所有培养基均加入30g·L-1蔗糖；诱导培养基加入5.20g·L-1琼脂；增殖及生根培养基加入6.00g·L-1琼脂；培养温度为25±1℃；光照强度为5000～6000lx；光照周期为12h·d-1。

1.2.6 移栽 当组培苗的根长1～2cm，根数目5～7条时，进行炼苗和移栽，将组培瓶移到自然光下闭瓶炼苗7d，待茎干变粗，叶片颜色加深、变厚后，然后再打开瓶封炼苗3d。炼苗完成后用镊子把组培生根苗取出，取清水冲洗干净组培苗根部的培养基，然后放入1000倍多菌灵溶液浸泡10～20min，再移栽到基质中。移栽苗床需采取遮荫、保湿措施，保湿办法采用全自动喷雾系统，每10min喷水10s，每7d定期喷施2000倍多菌灵液预防病害，1个月后逐渐揭开遮阳网，增加光照强度。

1.3 数据统计分析

方差分析采用DPS 7.05，多重比较采用LSD检验。

2 结果与分析

2.1 外植体消毒时间比较

经过不同消毒处理，外植体接种10d后，统计无菌外植体的试验结果见表3。

表3 不同消毒时间获得无菌外植体统计Tab.3 The statistical table of the sterile explants obtained by different sterilization times消毒时间/min接种数/个污染数/个死亡数/个无菌数/个平均污染率/%平均死亡率/%平均无菌比/%4.56042±2 aA 4±1 aA14±2 a 70.0 6.723.35.56012±3 bB 6±1 aA42±3 bB20.0 10.0 70.0 6.560 6±1 cB30±3 bB24±3 cB10.0 50.0 40.0 注:方差分析结果同列数据小写字母表示在0.05水平上的差异显著性;同列数据大写字表示在0.01水平上的差异显著性。下同。

由表3可知，3种处理中，消毒时间5.5min处理效果最好，无菌外植体平均无菌比为70.0%，无菌数极显著高于消毒时间4.5min处理，显著高于消毒时间6.5min处理；消毒时间4.5min处理，灭菌时间不够，平均污染率达到70.0%，污染数极显著高于其它两种处理；灭菌时间6.5min处理，因消毒时间过长导致外植体被杀死，平均死亡率达50.0%，死亡数极显著高于其它两种处理。

2.2 植物生长调节剂浓度对愈伤组织及不定芽诱导的影响

在含不同浓度植物生长调节剂6-BA、NAA的MS培养基中，2周左右叶柄伤口膨大产生少量浅绿色愈伤组织，外植体体积比刚接种时增大1/3，在培养30d后产生少量再生芽，再转瓶培养20d，累计培养50d后，外植体叶柄及叶脉处小芽增多，部分小芽长达1.5cm，芽色嫩绿，可以看出叶柄及叶脉具有很强的再生能力。植物生长调节剂6-BA和NAA对不定芽诱导率因浓度而异，采用L9(33)正交试验设计筛选出不定芽诱导的最佳处理。试验结果见表4。

表4 响叶杨不定芽诱导正交试验结果Tab.4 The orthogonal test results of adventitious bud induction of Populus adenopoda Maxim处理6-BA/(mg·L-1)NAA/(mg·L-1)接种数/个分化数/个平均分化率/%诱导分化情况1—71.000.103027±2 aA90.0 叶片卷曲膨大,绿色,致密,伤口处不定芽多、粗壮1—81.000.153024±2 bAB80.0 叶片膨大卷曲,呈绿色、部分红褐色,致密,不定芽多,较粗壮1—40.800.103024±2 bB80.0 叶片卷曲膨大,绿色,致密,不定芽分化较多1—50.800.153022±2 bcBC73.0 叶片卷曲膨大,绿色,致密,不定芽较多1—60.800.203021±1 cBC70.0 叶片卷曲膨大,绿色,疏松,不定芽分化较多,不定芽长较多1—91.000.203020±1 cC67.0 叶片卷曲膨大,绿色,疏松,不定芽较多、小部分外植体枯黄1—10.500.103013±2 dD43.0 叶片卷曲膨大,绿黄色,部分红褐色,部分外植体枯黄;诱导的丛生芽少,生长慢1—30.500.203010±2 eDE33.0 叶片卷曲膨大,绿黄色,部分叶片枯黄,愈伤较多,不定芽长势弱1—20.500.1530 9±1 eE30.0 叶片卷曲膨大,绿黄色,部分外植体枯黄;诱导的丛生芽少,生长慢

由表4可知，由于不同诱导培养基的影响，响叶杨叶片不定芽平均诱导分化差异非常明显，最适合诱导和分化不定芽的培养基为处理1 — 7，方差分析显示，其分化个数显著高于处理1 — 1、处理1 — 2、处理1 — 3、处理1 — 4、处理1 — 5、处理1 — 6、处理1 — 8和处理1 — 9，极显著高于除处理1 — 8之外的所有处理。

2.3 植物生长调节剂对不定芽增殖培养的影响

在增殖培养基上将芽团转接，培养一个月左右后，增殖芽在含不同植物生长调节剂浓度培养基上的生长情况见表5。

由表5可见，当芽团接种于处理2 — 9，处理2 — 8处理2 — 7培养基时，不定芽平均增殖倍数为3.7～4.5。处理2 — 9植物生长调节剂NAA浓度为0.20mg·L-1时，培养基增殖丛芽更多，增殖苗平均高度中等，芽团基部产生较多的愈伤组织，增殖芽数方差分析表明，其增殖芽数显著高于其他所有处理，极显著高于除处理2 — 8之外的所有处理；处理2 — 8植物生长调节剂NAA浓度为0.15mg·L-1时，不定芽平均增殖倍数达4.0，增殖芽数方差分析显示，其增殖芽数显著高于处理2 — 1至2 — 6。

增殖苗高方差分析结果表明，处理2 — 7、处理2 — 8增殖苗高较除处理2 — 5之外的其它6种处理差异极显著；处理2 — 5较处理2 — 9增殖苗高差异显著，但未达极显著水平，较处理2 — 1、2 — 2、2 — 3、2 — 4、2 — 6增殖苗高差异极显著。

综合平均增殖芽数和增殖苗高的情况，处理2 — 8虽然增殖芽数显著低于处理2 — 9，但其增殖苗高极显著高于处理2 — 9，且其增殖苗健壮，生长旺盛，总体增殖效果更好。试验观察到，当温度超过28℃，或是琼脂浓度低于6.00g·kg-1时，增殖培养超过35d，组培苗容易出现玻璃化现象。

2.4 不同植物生长调节剂对生根的影响

增殖苗在移入含植物生长调节剂NAA的1/2 MS培养基10d左右后，无菌苗基部开始长出白色根点，随着根的生长，无菌苗进一步生长壮实。4种处理试验结果(见表6)显示，1/2 MS+0.10mg·L-1NAA培养基处理的响叶杨生根率高达98.0%，生根数量最多，且根长适中，移栽方便。

生根率方差分析显示，0.10mg·L-1NAA培养基与0.20mg·L-1NAA培养基处理的生根率差异显著，但未达极显著水平，与0.05mg·L-1NAA培养基处理的生根率差异极显著。

生根数方差分析显示，0.10mg·L-1NAA培养基与0.20mg·L-1、0.05mg·L-1NAA培养基处理的生根数差异显著，但未达极显著水平；0.15mg·L-1、0.20mg·L-1、0.05mg·L-1NAA培养基处理的生根数相互之间差异不显著。

根长方差分析显示，0.05mg·L-1NAA培养基处理较其它3种处理根长差异极显著；0.10mg·L-1、0.15mg·L-1NAA培养基处理根长之间差异不显著，2种培养基处理的根长都较0.20mg·L-1NAA培养基处理差异显著，但未达极显著水平。

2.5 移栽效果

本次试验移栽所用的容器为塑料容器袋，塑料容器袋保湿性较好，但透气、透水性不够，易引发病害。试验采用了全自动间歇喷雾系统，以保证移栽初期较高的叶面湿度。基质配比为树皮∶珍珠岩∶黄土=1∶1∶1，有利于多余的水分迅速排掉，防止移栽苗由于水份过多而腐烂。移栽2周后，每周使用1/2 MS营养液喷洒移栽苗一次，连续喷洒3～4周，一个月后可达92.0%的成活率。

3 结论与讨论

本研究通过野外采集响叶杨枝条，再带回研究地通过芽苞嫁接、温室培育等预处理手段以获得足够多的试验材料。在此基础上，系统开展了响叶杨的外植体消毒、瓶内诱导、增殖培养、生根培养和移栽技术研究。相较于国内其他研究人员开展的白杨、响叶杨组培试验，本研究有如下独特性：

(1)野外采集的外植体脱毒一直是组培技术的难点，不同于杨树组培实验室常见的外植体水培方法，本研究增加外植体芽苞嫁接、温室培育等预处理手段，以减轻野外采集的外植体脱毒难度，同时有利于提供充足数量的试验用外植体。

(2)叶片诱导分化的适宜培养基为处理1 — 7(MS+1.00mg·L-16 — BA+0.10mg·L-1NAA)；在培养30d后产生少量分化芽，50d左右，分化芽增多，同时分化芽长大。试验与朱忠荣等[12]研究的分化时间基本一致，但与其所用的WPM培养基配方不一致，根据其试验结果，培养基配方为WPM+1.00mg·L-16 — BA+0.10mg·L-1NAA时，诱导叶面有突起，但无芽分化，适宜的配方为WPM+1.00mg·L-16 — BA+1.00mg·L-1NAA，可见在响叶杨外植体的诱导分化上，不同类型基础培养基能影响6 — BA与NAA的作用发挥；50d的诱导培养中，在30d的时候进行了一次转瓶培养，目的是防止外植体培养基营养不足；处理2-8(MS+0.40mg·L-16 — BA+0.15mg·L-1NAA)为合适不定芽继代培养基；1/2 MS+0.10mg·L-1NAA为适合的生根培养基。

(3)移栽苗床使用全自动间歇喷雾系统，充分保证了移栽初期较高的叶面湿度，试验基质选用树皮∶珍珠岩:黄土=1∶1∶1，1个月后移栽成活率可达92%，比朱忠荣等[12]研究的火土∶田园∶腐熟肥=1∶1∶1基质及人工浇水成活率要高12%。移栽成活率大幅提升，原因在于试验基质中的树皮和珍珠岩具有较高透气性和沥水性，组培苗不易发生病菌感染，使用全自动间歇喷雾比人工浇水更能有效保障组培苗的水分维护。

(4)响叶杨继代芽生长速度很快，当继代培养温度高于28℃时，组培苗玻璃化现象很容易出现。组培苗叶子卷曲变窄，绿色增厚，较像扫帚，有的会枯死。因此，在规模化生产时，增殖继代培养要及时转瓶，不仅能使培养空间有效利用，还能使芽的质量得到保证。同时可以把增殖瓶放在培养室内温度相对低一点的地方进行培养，培养的各阶段要根据生长情况，对琼脂浓度进行合理的调配。

(5)组培苗移栽前属异养型生长，生长营养由培养基提供，瓶苗叶表面无蜡质，叶孔处于打开状态，几乎无木质化，苗子脆弱，因此移栽前对瓶苗进行炼苗非常重要，炼苗能使瓶苗逐渐适应外部自然条件。组培苗移栽后非常容易失水萎蔫、死亡，移栽初期一定要做好定时喷雾保湿及遮荫防晒工作。

(6)试验仅对响叶杨叶片组培技术进行了研究，下一阶段可进一步对响叶杨茎段等其它部位的组织培养技术进行研究[13-15]，为响叶杨这一优良山地杨树的无性系繁殖及快速推广提供技术支撑，并为未来响叶杨的分子遗传育种打下技术基础。