曙红Y与恩诺沙星相互作用的分光光度法研究

恩诺沙星（EN）为动物专用的杀菌性广谱抗菌药，适用于牛、猪、禽、犬、猫和水生动物的敏感细菌及支原体所致的消化系统、呼吸系统、泌尿系统及皮肤软组织的各种感染性疾病。主要用于支原体病、巴氏杆菌病、大肠杆菌病、沙门氏菌病、链球菌病等。目前对恩诺沙星的检测方法有高效液相色谱法[1]和紫外分光光度法[2]。在原有研究基础上[3]，本文进行了曙红Y（EY）与恩诺沙星（EN）相互作用的分光光度法研究，建立了曙红Y测定恩诺沙星的新方法，用于恩诺沙星溶液中恩诺沙星含量的测定，结果满意。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂PE公司lamda35型双光束紫外光谱仪；BT 224S分析天平（Sartorius公司）；恩诺沙星（中国兽医药品监察所，批号H0081505，含量99.5%）：4.84×102mg·L-1(0.01mol·L-1NaOH)：5.0×10-4mol·L-1曙红Y溶液；0.01%乙烯吡咯烷酮（PVP）溶液；恩诺沙星溶液（林州中农颖泰生物肽有限公司，批号为S190317061，规格为100ml：5g）；所用水为纯化水；其他试剂为分析纯。

1.2 实验方法在10mL容量瓶中依次加入1.00mL曙红Y溶液、适量恩诺沙星标准溶液或待测液、1.0mL PVP溶液，加0.01mol/L盐酸6.0mL，用水稀释至刻度，摇匀，以水为参比立即进行光谱扫描或固定波长为536nm进行吸光度测定。

2 结果与讨论

2.1 吸收光谱以水为空白，对体系进行光谱扫描，结果见图1。由图1可知，恩诺沙星（15mg·L-1）最大吸收峰在271nm，曙红B（5.0×10-5mol·L-1）可见区最大吸收峰在516nm，加入恩诺沙星后体系在可见区的最大吸收红移到536nm，红移20nm，且吸光度明显增加。说明体系中应该有恩诺沙星与曙红Y的复合物生成。

2.2 酸度对体系的影响在10mL容量瓶中，依次加入1.00mL曙红Y溶液、0.30mL恩诺沙星标准液，分别用1、0.1、0.01、0.001mol/L盐酸稀释至刻度，摇匀，以水为参比立即进行光谱扫描，结果发现用0.01mol/L盐酸稀释后体系最大吸收波长红移最大。随后考察了0.01mol/L盐酸加入体积的影响，结果发现体系中加入4～8.5mL 0.01mol/L盐酸时，最大吸收波长红移波长最大、红移波长数稳定、在536nm波长处体系和曙红Y吸光度的差值最大，选择0.01mol/L盐酸加入量为6.0mL。

2.3 体系吸光度的稳定性体系的吸光度随时间减小，10min后溶液变浑浊并慢慢产出沉淀，为了提高体系的稳定性考察了非离子表面活性剂对吸光度的影响，结果发现加入0.01%PVP1.0mL后体系不再发生浑浊、吸光度可以稳定6h以上。

图1 吸收光谱

2.4 最大结合数的测定固定恩诺沙星浓度为1.65×10-5mol·L-1，改变曙红Y的浓度，以相应的试剂空白为参比测定体系的吸光度。以吸光度为纵坐标，以n（cEY/cEN）为横坐标作图，结果见图2。由图可知，n=1时出现一明显折点。依据摩尔比法原理，恩诺沙星与曙红Y的最大结合数为1。

图2 摩尔比法

2.5 离子强度的影响实验用NaCl考察了离子强度对体系的影响。发现，体系中加入NaCl后，体系中NaCl浓度为0.02 ～ 0.1mol·L-1时，吸光度随NaCl浓度增大而缓慢变小。吸光度变小，表明恩诺沙星与曙红Y可能主要通过静电引力结合。

2.6 表面活性剂的影响及反应机理探讨加入0.01% PVP 1.0mL，体系吸光度有一定的增大。加入阴离子表面活性剂十二烷基苯磺酸钠（SDBS，0.1%，0.5mL），体系的吸光度几乎完全猝灭。加入的阳离子表面活性剂溴化十六烷基三甲基胺（CTMAB，0.1%，0.1mL），体系的吸光度显著增大。

非离子表面活性剂PVP的存在可能会聚集体系中EN与EY的复合物，形成胶束增敏体系使体系的吸光度增大。

对EY中加入EN和CTMAB的体系进行光谱扫描，结果见图 3。由图可知，EN（4.84 mg·L-1）与 CTMAB（10 mg·L-1）的加入都能使 EY（5.0×10-5mol·L-1）的最大吸收波长发生红移，推测EN、CTMAB与EY的结合方式是相似的。CTMAB与EY的结合可能主要是CTMAB分子中的季铵N+正电荷与EY分子中的羧酸基－COO－负电荷间的作用。EN分子中有叔胺，在酸性条件下，容易形成季铵N+正电荷，可以和EY分子中的羧酸基－COO－负电荷结合生成离子复合物（EN和EY分子结构图见图4）。

图3 吸收光谱

大量SDBS（50mg·L-1）的存在会抑制EY与EB复合物的形成，因为静电引力是一种非定向性的作用力，在大量SDBS阴离子的存在下，EN大部分可能会与SDBS结合，生成EN与SDBS的复合物，从而抑制EN与EY复合物的生成，而EN与SDBS的复合物在536nm没有吸收或有很弱的吸收，从而使体系的吸光度产生严重猝灭。因而，推测恩诺沙星与曙红Y主要通过静电引力结合形成结合比为1：1的离子复合物。

2.7 线性范围、检出限和精密度恩诺沙星在4.8～14.4 mg·L-1浓度范围内服从比尔定律；回归方程为：A = 0.0194c（mg·L-1）+ 0.4379，相关系数为0.9990。按cL＝3S/K得方法检出限为 0.4mg·L-1。对浓度为 9.6 mg·L-1的恩诺沙星标准溶液进行平行测定求得相对标准偏差RSD＝0.8%（n=6）。

2.8 样品测定精密量取样品恩诺沙星溶液1mL，置100mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀；按实验方法对样品进行分析，结果见表1。

表1 恩诺沙星溶液的测定和回收(n=6)