冠突散囊菌分生孢子产孢条件研究

陈 怡，刘石泉，李滔滔，余松林，汪无忌，胡治远

(湖南城市学院 黑茶金花湖南省重点实验室，湖南 益阳413000)

冠突散囊菌(Eurotium cristatum)是散囊菌属的一种真菌，作为茯砖茶发花过程中的优势微生物而被人们所熟知，其在茶叶中生长，可代谢转化茶叶中的化学成分，并生成一系列生理活性物质，有改良茶叶品质和提升保健功效的作用[1]﹒利用冠突散囊菌加工的黑茶或其他发酵产品，在减肥[2]、降脂[3]、抗氧化[4]和调节人体免疫[5]等方面的生理活性作用尤为显著﹒近年来，冠突散囊菌已成为微生物资源领域研究的热点，对其生理特性、发酵工艺和分类鉴定等方面的研究较多﹒在人工培养或自然条件下，冠突散囊菌主要通过有性结构子囊孢子进行繁殖[6]，而无性型孢子—分生孢子则鲜少出现；并且其分生孢子呈较浅的灰绿色[7]，常规培养基上不易被观察到，这限制了对冠突散囊菌的全面了解﹒参考郑欣欣[8]和吕嘉枥等[9]的研究结果可知，高渗培养基和高温环境等可促使冠突散囊菌生殖方式由有性型向无性型转变﹒但对于冠突散囊菌无性孢子的具体产孢条件及其发酵工艺优化方面的研究则尚未见于报道，这不利于对冠突散囊菌这一重要微生物资源的进一步认识与利用﹒鉴于此，本文通过探索不同培养条件下诱导冠突散囊菌分生孢子的最佳产孢工艺，以期为研究冠突散囊菌两性发育和产孢机制等提供试验基础﹒

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌种

冠突散囊菌(JH1205)由黑茶金花湖南省重点实验室提供﹒

1.1.2 培养基

菌种活化与培养采用改良PDA 培养基，制备方法如下：200 g 马铃薯切片，加水煮沸后持续30min，过滤去除马铃薯渣，添加100 g 蔗糖、5 g NaCl 和20 g 琼脂粉并搅拌溶解，补充蒸馏水定容至1 000m L﹒

1.2 仪器设备与试剂

YP802N 型电子分析天平(上海精科仪器设备公司)；VD-650单人型超净工作台(迎工机械有限公司)；DHP-9810型生化培养箱(上海一恒仪器有限公司)；JSM-6380LV 型扫描电子显微镜(日本日立电子株式会社)；CFIS60型倒置显微镜(江南永新仪器有限公司)；HY-4A 型振荡器(湖南力辰仪器科技有限公司)；XFH-70C型自动蒸汽灭菌锅(浙江新丰仪器有限公司)﹒试验所用NaCl、琼脂粉和蔗糖等试剂均为国产化学纯﹒

1.3 试验方法

1.3.1 冠突散囊菌孢子悬液的制备

取菌落长势良好的PDA 平板，注入无菌水并用菌种刮铲刮取菌落上的孢子，将菌液适度稀释并振摇均匀后，获得冠突散囊菌孢子悬液(经血球计数板法检测孢子数量为106个/mL)，以此作为接种液﹒

1.3.2 不同浓度蔗糖诱导培养试验

制备PDL 液体培养基：每1 000 mL 培养基使用300 g 马铃薯，设置NaCl含量为10%，分装后添加不同质量的蔗糖，分别配制出蔗糖含量为5%，10%，15%，20%，25%和30%的6组PDL培养液；高压蒸汽灭菌后，在超净工作台上将培养液按每瓶100mL 分装至400mL 植物组织培养瓶，每个蔗糖浓度梯度设置3组平行；最后用移液枪接种1 mL 冠突散囊菌孢子悬液，轻微摇匀后置于28℃恒温箱静置培养﹒

1.3.3 不同浓度NaCl 诱导培养试验

液体培养基的制备同1.3.2，设置NaCl梯度为4%，6%，8%，10%，12%和14%，每组样品设置3个平行，按1.3.2 的方法接种孢子悬液并置于28℃环境培养﹒

1.3.4 不同温度诱导培养试验

液体培养基的制备同1.3.2，设置蔗糖浓度为10%、NaCl浓度为10%，按1.3.2 的方法接种孢子悬液，分别置于28，30，32，34，36和38℃的恒温培养箱中静置培养，每个试验组设置3个平行﹒

1.3.5 冠突散囊菌两性孢子的观察与区分

挑取生长状况适宜的菌体制成固定标本，采用离子溅射仪对样品表层进行喷金处理后[10]，在扫描电镜下观察其有性形态及无性形态；配合电镜观察的结果，在倒置显微镜下观察并进一步确认两性形态的结构差异；综合菌落表面形态、倒置显微镜及电子显微镜观察的结果，确认冠突散囊菌无性生殖形态的特征﹒

1.3.6 冠突散囊菌分生孢子的计数

挑取一瓶培养瓶内的全部菌体，置于100m L摇瓶内，加入少量无菌生理盐水和玻璃珠，置于振荡器上300 r/min 振摇打散菌体；过200 目筛以获得含有孢子的滤液，用无菌生理盐水重复洗涤、过滤6次以充分洗脱附着在菌体上的孢子；合并孢子滤液定容至1 000m L并再次混匀，采用血球计数板法[11]在倒置显微镜下统计冠突散囊菌分生孢子的数量，计算出每毫升培养液通过发酵后获取的冠突散囊菌分生孢子数量(个/mL)﹒

1.3.7 冠突散囊菌产分生孢子的正交优化试验

依据1.3.2 ～1.3.4 单因素试验的结果，确定不同的蔗糖浓度、NaCl浓度和发酵温度3个因素的具体参数，设计3因素3水平的正交试验进一步优化冠突散囊菌液态发酵产分生孢子的工艺，每组发酵条件设置3组平行，结果取平均值，试验因素及水平设计如表1所示﹒

表1 正交试验的因素与水平

获取最佳条件工艺后，在此培养条件下开展验证试验，接种及培养方法同1.3.2，平行培养5组，通过相对标准偏差评估试验结果的精密度﹒1.3.8 菌株JH1205产分生孢子的培养时间优化

根据1.3.7 正交试验优化的结果进行液体培养，并于培养的第4，5，6和7 d 观察并检测培养液中分生孢子含量，确定优化发酵工艺下冠突散囊菌分生孢子最佳产孢时间﹒

2 结果与分析

2.1 冠突散囊菌的两性型形态差异

冠突散囊菌的两性型差异如图1所示﹒

图1 冠突散囊菌的两性型差异

由图1不难发现，其有性型与无性型的差异较为显著：有性型菌膜呈现金黄色，菌膜表面粗糙而致密，菌膜中央部位偶尔可见黑褐色香油状渗出液，随生长时间的延长，菌膜颜色逐渐变深成为棕黄色，且渗出液增多，到后期则完全转变为黑褐色；无性型菌膜紧致而细密，表面相对有性型较为光滑，无渗出液，菌膜色泽呈较均匀的灰绿色，和有性型区分度较高(见图1A)﹒在电镜观察下，未成熟的闭囊壳为椭球状(见图1B)，外表缠绕有大量营养菌丝，直径100～150μm；子囊孢子表面粗糙具尖疣(见图1C)，赤道部位具有显著的冠状突起，大小4～5μm×5～6μm；光镜观察下，子囊孢子与电镜形态基本一致，可通过其双凸镜的造型与分生孢子区分开来(见图1D)﹒电镜观察下，分生孢子头由菌丝特异化形成，形似扫帚状，孢子梗上串生有大量分生孢子(见图1E)，随时间延长而逐渐增大；成熟的分生孢子从孢梗茎上脱落(见图1F)，孢子呈椭球状，外壁布满小点状突起，直径4～5μm，其形状相对子囊孢子较为规则﹒冠突散囊菌两性型的形态差异与谭玉梅等[12]的研究结果基本一致，电镜下偶尔可观察到有性型和无性型分布在一个视野内(见图1H)，可通过表观形态和显微特征等将其有性型与无性型有效区分开来﹒

2.2 不同浓度蔗糖对冠突散囊菌分生孢子产量的影响

当发酵液NaCl 含量为10%、培养温度28℃和培养时间5 d 时，不同浓度蔗糖对冠突散囊菌分生孢子的生长影响如图2所示﹒

图2 不同浓度蔗糖对冠突散囊菌分生孢子产量的影响

在图2中，当蔗糖含量在5%～15%之间时，随蔗糖浓度的上升，分生孢子产量也随之快速提高；当蔗糖含量在15%～25%之间时，孢子产量仍然与蔗糖浓度正相关，但提升速度开始减缓；当蔗糖含量为25%时，孢子产率达到最高值4.13×107个/mL，比蔗糖含量5%时提高了接近3倍﹒这说明，蔗糖作为冠突散囊菌适宜利用的碳源[9]，一方面可以促进发酵液中的菌体生长，有效提高总生物量；另一方面，高浓度蔗糖使得培养液渗透压上升，也可以促使其繁殖方式由有性型向无性型转变，提高分生孢子的产率﹒但蔗糖含量进一步提高至30%时，孢子产率反而有所下降，有可能是蔗糖导致培养液渗透压过高，反过来抑制了菌体的生长；亦有可能是过高浓度的蔗糖使培养液变得粘稠，导致底物流动性下降，不利于菌体的发育﹒因此，单因素试验最适宜的蔗糖添加量选定为25%﹒

2.3 不同浓度NaCl对冠突散囊菌分生孢子产量的影响

当发酵液蔗糖含量为10%，培养温度为28℃，培养时间为5 d 时，不同浓度NaCl对冠突散囊菌分生孢子的生长影响如图3所示﹒

图3 不同浓度NaCl 对冠突散囊菌分生孢子产量的影响

由图3可知，在NaCl 浓度较低(＜8%)时，冠突散囊菌繁殖方式以有性的子囊孢子为主，随着NaCl 浓度的增加，发酵液中灰绿色分生孢子的比例逐渐增加；当发酵液NaCl 浓度≥8%后，无性繁殖则开始占据主导，尤其是在NaCl 浓度≥10%的发酵液中，基本未见金黄色闭囊壳结构﹒NaCl浓度为10%时分生孢子产量达到最高值2.28×107个/mL，说明适当浓度的NaCl 可以通过改变细胞膜内外渗透压和影响代谢方式来改变菌株的生殖模式[13]﹒而当NaCl 的浓度再进一步提升时，分生孢子产量显著下降，由发酵液中较低的菌体生物量可以推测，高浓度的NaCl 对冠突散囊菌营养菌丝的生长有一定抑制作用，从而导致了产孢量的减少﹒

2.4 不同发酵温度对冠突散囊菌分生孢子产量的影响

当发酵液NaCl含量为10%、蔗糖含量10%和培养时间5 d 时，不同培养温度对冠突散囊菌分生孢子的生长影响如图4所示﹒

图4 不同发酵温度对冠突散囊菌分生孢子产量的影响

由图4可知，当培养温度处于28～34℃时，随着温度的升高，冠突散囊菌分生孢子的产量随之上升，在34℃时孢子产量达到最大值3.08×107个/mL﹒这说明在同样的培养基条件下，不同的生长温度会影响冠突散囊菌基因的表达，使得其繁殖模式发生转变，从而大量产生抗逆性较强的分生孢子，这一点和其它真菌在不同环境条件下的两性繁殖模式是类似的[14]﹒当温度高于34℃时，随着温度的升高，分生孢子的产量却开始下降，其主要原因可能是冠突散囊菌作为一种真菌，其菌丝最适宜的生长温度为28℃左右[15]，故对高温的耐受能力相对较差，而在菌丝生物量较低的情况下，会影响分生孢子的产生﹒

2.5 冠突散囊菌产分生孢子的正交优化试验

在单因素试验的基础上，开展不同的蔗糖浓度、NaCl 浓度和发酵温度的3因素3水平正交试验，结果如表2所示﹒

表2 不同培养条件的正交试验结果

由表2可知，不同因素对分生孢子产率的影响的大小依次为：NaCl浓度＞发酵温度＞糖浓度，优化后的最佳产孢条件为A1B2C2，即蔗糖含量20%、NaCl含量10%和培养温度34℃，此条件下培养获得的孢子产量为6.91×107个/mL﹒

2.6 优化产孢条件验证试验

制作蔗糖含量为20%、NaCl 含量为10%的PDL 液体培养基，按1.3.2 中的方法分装灭菌与接种，并置于34℃环境下培养5 d﹒结果显示：5组平行培养液分生孢子产量分别为6.40，6.51，6.63，6.99和7.54(×107个/mL)，可见孢子产量在(6.40～7.54)×107个/mL之间波动，平均产量为6.81×107个/mL，相对标准偏差RSD为0.067 9，表明该优化培养条件可重复性较好，能在液态发酵中有效提升冠突散囊菌分生孢子的产量﹒

2.7 不同培养时间对冠突散囊菌分生孢子产量的影响

采用正交试验法得到的优化工艺进行培养，并于培养的第4，5，6和7 d 观察并检测培养液中分生孢子含量，结果如图5～图6所示﹒

图5 不同培养时间对冠突散囊菌分生孢子产量的影响

图6 不同培养时间对冠突散囊菌菌膜表面的影响

由图5可知，当第4～5 d 时，分生孢子产量随时间延长提升较快，其间24 h 的发酵使分生孢子浓度提高了2.18×107个/mL，此时菌膜均呈现无性型为主的灰绿色(见图6A 和图6B)；当培养时间超过5 d 时，进一步提升发酵时间对分生孢子的产量影响较小﹒观察发酵液可知，从培养的第6 d 起，菌膜表面开始少量生长子囊孢子(见图6C)；到第7 d 时，菌膜则开始大量附着子囊孢子导致其色泽由先前的灰绿色转化为金黄色(见图6D)﹒由此表明，冠突散囊菌以有性型作为其繁殖的主要模式，即使在适宜培育无性型的环境条件下，仍会随着培养时间的延长而逐渐转化至有性型﹒根据葛永怡等[16]的研究可知，和冠突散囊菌产孢相关的MAT 1-1-1 基因在不同生长阶段的差异性表达，可能是造成这一现象的主要原因﹒鉴于子囊孢子的产生会对无性型的观察与研究造成一定影响，因此本文最终选择5 d 为产分生孢子的最佳发酵时间﹒

3 讨论与结论

通过单因素试验及正交试验，探寻不同的蔗糖浓度、NaCl 浓度、培养温度和发酵时间对冠突散囊菌分生孢子的产孢影响﹒结果表明：PDL 液体培养基添加20%蔗糖和10%NaCl，以及培养温度34℃和培养时间5 d 是分生孢子的最佳发酵工艺条件，且孢子产量平均值达到6.81×107个/mL﹒此发酵工艺可快速制备冠突散囊菌分生孢子，用以作为菌种代谢特性和分子信息等研究的材料﹒对比郑欣欣[8]的研究可知，本文所提冠突散囊菌分生孢子产孢工艺与子囊孢子产孢工艺之间有着显著差异，即不仅需要较高渗透压和温度，且其产孢周期也相对较快﹒由Ge等[17]对冠突散囊菌两性型基因转录组测序的分析结果可知，外界因素可调控冠突散囊菌生殖基因的表达，能决定真菌最终的繁殖模式﹒总而言之，诱导冠突散囊菌产生分生孢子的关键因素为渗透压胁迫和一定程度的高温﹒虽然添加NaCl 和蔗糖都能有效提高培养液渗透压，但NaCl对分生孢子产生的影响显著大于蔗糖，可能是Na+能更大限度地改变冠突散囊菌细胞膜的通透性，促使膜内外物质的交换，因此诱导产孢效果较好；而蔗糖主要是作为碳源来影响冠突散囊菌的菌丝生长，其通过调节生物量的方式影响产孢效果﹒本研究结果明确了冠突散囊菌分生孢子产孢工艺，为进一步了解和发掘这一微生物资源提供了基础﹒