2010－2018年安徽省马鞍山市腹泻患者中非伤寒沙门菌的分子分型与耐药性研究

洪 颖，王 利，陈 谨，王 蓉，罗 颖，杨 晨，陈道利，柳 燕

非伤寒沙门菌是指除伤寒和副伤寒以外的各种沙门菌，是一种常见的人兽共患传染性疾病的病原菌，也是感染性腹泻的重要病原菌。一项非伤寒沙门菌疾病负担报告显示，全球每年有9 400万人因沙门菌患病，15.5万人死亡[1]。据欧洲食品安全管理局(Efsa)报道，2016年欧盟超过9.4万例感染是由非伤寒沙门菌引起的[2]。在我国由非伤寒沙门菌引起的食物中毒事件多年来居细菌性食物中毒首位[3]。非伤寒沙门菌血清型构成和优势型别存在一定的地域特异性[4]，而不同血清型非伤寒沙门菌的耐药性也存在显著不同[5]，因此，非伤寒沙门菌的血清分型及耐药性研究对临床研究和疾病防控都有着十分重要的意义。随着分子生物技术的发展，对非伤寒沙门菌的监测也进入了分子水平，PFGE技术是一种非常有效的追踪感染源的分子分型方法，在流行病学调查、食源性疾病监测和溯源等工作中均发挥着重要作用[6]。

基于马鞍山区域腹泻人群中非伤寒沙门菌的感染状况、流行特征、血清型分布和分子分型等基线数据库尚未建立，为了解本地区非伤寒沙门菌的流行状况和病原学特征，现对2010－2018年来源腹泻患者的非伤寒沙门菌进行血清学分型PFGE分型和耐药性分析。

1 材料与方法

1.1 标本来源 选择马鞍山市二院、四院、中心医院和当涂县医院4家定点医院作为腹泻监测哨点，收集2010－2018年以腹泻症状为主诉、每日腹泻≥3次、粪便性状异常的感染性腹泻病例标本共2 998份，同时收集病例基本信息和流行病学史;标本置于Carry-Blair培养基中冷藏运送。

1.2 主要试剂与仪器 SBG增菌液(美国BD)，沙门显色培养基(英国OXOID)，克氏双糖琼脂(KIA)培养基(英国 OXOID)，SS培养基(英国 OXOID)，XLD培养基(美国BD)，XbaⅠ酶(美国 New England Biolabs)，蛋白酶 K(美国 Amresco)，Sea Ke m Gol d琼脂糖(美国Lonza)，Gel Red染料(美国Biotiu m)，诊断血清(丹麦SSI)，药敏检测板(上海星佰)，CHEF MAPPER型脉冲场凝胶电泳仪(美国Bio-Rad)，Gel Doc XR＋凝胶成像系统(美国 Bio-Rad)，VITEK 2 compact全自动细菌生化鉴定仪(法国 梅里埃)，菌液比浊仪(美国Ther mo fisher)。

1.3 方 法

1.3.1 分离与鉴定 将粪便标本保存液接种至SBG增菌液，36℃培养18 h，然后分别接种于沙门显色培养基、SS培养基和XLD培养基，36℃培养24 h。从中挑取数个可疑菌落接种于克氏双糖琼脂，36℃培养24 h。可疑菌落用VITEK2全自动生化鉴定仪进行菌种鉴定。鉴定为沙门菌的菌株依据文献[7]确定血清型别。

1.3.2 PFGE分型 按照Pulse Net China“沙门菌PFGE标准操作程序”操作，以沙门标准菌株H9812作为PFGE分子量标准，选用Xba I酶37℃酶切3 h，电泳19 h，电泳液温度14℃。电泳结束后用Gel Red对胶块进行染色，去离子水洗脱。Bio-Rad凝胶成像系统拍照，Bio Nu merics7.6软件进行聚类分析。

1.3.3 药敏试验 按照革兰阴性需氧菌药敏检测板说明书操作，参照美国临床实验室标准化委员会(CLSI-2018)标准对结果进行判读。试验使用的抗生素有氨苄西林(A MP)、头孢唑啉(CFZ)、头孢西丁(CFX)、头孢噻肟(CTX)、头孢他啶(CAZ)、头孢吡肟(FEP)、氨曲南(AZM)、亚胺培南(I MI)、美罗培南(MEM)、氨苄西林/舒巴坦(A MS)、阿莫西林/克拉维酸(A MC)、四环素(TET)、多西环素(DOX)、米诺环素(MIN)、庆大霉素(GEN)、阿米卡星(A MI)、卡那霉素(KAN)、链霉素(STR)、阿奇霉素(AZI)、萘啶酸(NAL)、左氧氟沙星(LEV)、环丙沙星(CIP)、复方新诺明(SXT)、磺胺异恶唑(Sul)、氯霉素(CHL)、多粘菌素E(CT)、多粘菌素B(PB)、头孢噻肟/克拉维酸(CTX/C)和头孢他啶/克拉维酸(CAZ/C)。

1.4 统计学及生物信息学分析 采用SPSS 20.0对数据进行统计分析，率的比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。用Bio Nu merics7.6软件对PFGE图谱进行分析处理。

2 结 果

2.1 流行特征

2.1.1 时间分布 2010－2018年马鞍山市腹泻患者中非伤寒沙门菌的感染率为8.8%(263/2 998)，其中2017年最高(16.0%，42/263)，年间感染率差异有统计学意义(χ2＝72.98，P＜0.001)。2014－2018年，除1月份外各月份均有非伤寒沙门菌检出，6－8月份感染率较高，见图1。

2.1.2 人群分布 2014－2018年腹泻患者中非伤寒沙门菌的感染率为11.4%(215/1891)，男性感染率为10.3%(106/1 028)，女性为12.6%(109/863)，不同性别检出率差异无统计学意义(χ2＝0.436，P＝0.509)。非伤寒沙门菌腹泻病例最小年龄为1岁，最大为91岁，年龄中位数为26岁，以0～5岁年龄组感染率最高(15.9%，88/554)，年龄组间感染率差异有统计学意义(χ2＝20.813，P＝0.001)，见表1。

图1 非伤寒沙门菌腹泻病例的时间分布情况Fig.1 Time distribution of Non-typhoid Salmonella diarrhea cases

表1 2014－2018年不同特征腹泻病例非伤寒沙门菌感染率的比较Tab.1 Comparison of Non-t yphoid Salmonella infection rates in different diarrhea cases from 2014 to 2018

2.2 血清型分布 263例非伤寒沙门菌病例中共分离出265株非伤寒沙门菌，共有36个血清型，主要为阿贡纳沙门菌(25.4%)、肠炎沙门菌(20.4%)和鼠伤寒沙门菌(20.0%)。不同年份优势血清型有所不同，2014年以肠炎沙门菌为主，2015年以鼠伤寒沙门菌为主，而2016和2017年以阿贡纳沙门菌为主，见图2。

图2 2010－2018年非伤寒沙门菌的血清型分布Fig.2 Serotype distribution of Non-typhoid Salmonella from 2010 to 2018

2.3 PFGE分型 为了解本地区是否发生过沙门菌腹泻的既往暴发并建立和完善沙门菌的分子分型数据库，本研究对所分离的非伤寒沙门菌进行了PFGE分型。下面列出了阿贡纳沙门菌的PFGE聚类图，62株阿贡纳沙门菌分为25种带型，带型相似度在54.7%～100%，带型相同的有8组，最多的组有19株，带型结果显示阿贡纳沙门菌有成簇出现的情况，见图3，其他非伤寒沙门菌未出现菌株成簇现象。

图3 阿贡纳沙门菌PFGE聚类图谱Fig.3 PFGE clustering patter n of Salmonella Agona

2.4 耐药性分析

2.4.1 耐药率 为了解本地区近年来2种优势沙门菌的耐药情况，本研究选取2015－2018年分离的39株肠炎沙门菌和30株鼠伤寒沙门菌，使用27种抗生素进行药物敏感性试验。结果显示测试菌株对A MP的耐药率最高为79.7%，对STR和Sul的耐药率较高分别为75.3%和66.6%，而对AZI和AMI全部敏感，见表2。

表2 69株非伤寒沙门菌对27种抗生素的耐药率(%)Tab.2 Resistance rate of 69 strains of Non-typhoid Salmonella to 27 antibiotics(%)

2.4.2 耐药谱 测试菌株的总耐药率为95.6%(66/69)，多重耐药率为82.6%(57/69)，耐7种及以上药物的菌株占30.4%(21/69)。耐药模式为A MP-TET-Sul-MIN-DOX-STR的菌株最多，占8.7%(6/69)。菌株最多可耐16种药，见表3。发现2株产ESBLs的菌株，1株为肠炎沙门菌，1株为鼠伤寒沙门菌，2株菌均为多重耐药菌株。

2.4.3 肠炎沙门菌与鼠伤寒沙门菌对各种抗生素敏感性的比较 肠炎沙门菌对四环素类药物(如TET、MIN和DOX)敏感性较鼠伤寒沙门菌高，而鼠伤寒沙门菌对喹诺酮类药物(NAL、CIP和LEV)敏感性较肠炎沙门菌高。此外，研究还发现，肠炎沙门菌对A MC、GEN和CHL的敏感性较高，而鼠伤寒沙门菌对CFZ和Sul的敏感性较高。以上差异均具有统计学意义(P＜0.01)，见表4。

表3 非伤寒沙门菌的耐药谱分布Tab.3 Dr ug resistance spectr um distribution of Non-typhoid Salmonella

表3 (续)

3 讨 论

近年来国内非伤寒沙门菌感染率有一定的地域性差异，本研究结果显示2010－2018年马鞍山地区腹泻患者中非伤寒沙门菌的流行特征，非伤寒沙门菌腹泻的平均感染率为8.8%，高于安徽合肥(2.9%)[8]，低于浙江余姚(12.9%)[9]。非伤寒沙门菌在0～5岁儿童组高发，这与我国多地区的研究结果一致[9-10]，可能与儿童免疫力低下有关。非伤寒沙门菌腹泻具有一定的季节性，6－7月为高发时间，可能由于此段时间内环境温度有利于非伤寒沙门菌的生长繁殖，导致沙门菌感染的几率增加。因此，建议民众应在感染高发季节注意饮食，监管部门应加强监管力度并做好防控措施。

感染性腹泻是发展中国家的常见疾病，非伤寒沙门菌是感染性腹泻的重要致病菌，其中肠炎沙门菌和鼠伤寒沙门菌一直是国内外公认的2种优势血清型[11]。而本地区的优势血清型为阿贡纳沙门菌，这与国内多地区[8-10，12]的结果均不一致，阿贡纳沙门菌为优势血清型是本地区的流行特点。

当今食品流通方式的多样化使食源性疾病的发病模式亦发生改变，由暴发转为多点散发。传统的分型方法已经不能满足食源性疾病在暴发中溯源的需求[13]，PFGE目前被广泛地应用于疾病的溯源。建立并完善沙门菌的分子分型(PFGE)数据库，对了解PFGE分型特点、流行病学分布、沙门菌的监测及暴发调查尤为重要[14]。阿贡纳沙门菌的PFGE聚类分析显示有菌株成簇现象，提示本地区可能出现过阿贡纳沙门菌腹泻的既往暴发或聚集性疫情。

由于抗生素和广谱抗菌药物的广泛应用，使得病原菌类型变化及耐药性增强成为感染领域中的首要问题[15]。有研究表明[16]2016年我国食源性沙门菌整体耐药水平较高，多重耐药严重，对 NAL、TET、A MP的耐受性较强，且耐药情况与2015年保持一致[17]。本研究结果显示，测试菌株对A MP、STR和Sul的耐药率较高，总耐药率和多重耐药率均高于北京昌平地区[18]。氟喹诺酮类和三代头孢类抗生素是临床上治疗沙门菌感染的一线用药[19-21]，而本研究中的测试菌株对三代头孢的敏感性大于90%，对喹诺酮类敏感性低于50%，提示临床需合理用药，避免抗生素滥用造成的耐药菌株的产生。研究还发现肠炎沙门菌对四环素类药物的敏感性较高，而鼠伤寒沙门菌对喹诺酮类药物的敏感性较高，这种差异是否与不同沙门菌的基因组结构有一定的相关性，具体原因还有待于进一步研究。

本研究的腹泻病例为监测人群非伤寒沙门菌感染数据，随着病例监测力度的加强和范围加大，以及医疗机构实验室检测能力提高，建立全覆盖本地区且监测多种类病原的局域网络实验室将是疾病监测的发展趋势，这样会更有利于及早发现和控制肠道传染性疾病。

表4 两种优势血清型沙门菌对药物敏感性的比较Tab.4 Comparison of drug sensitivity between two dominant serotypes of Salmonella