罗伊氏乳杆菌对肠道环境影响的实验教学探索

蒋 敏， 李 恒， 李 会， 史劲松

（江南大学药学院，江苏无锡214000）

0 引 言

微生物实验是我院制药工程专业本科教学的核心基础课程之一，在本专业技能培养中具有极其重要的意义［1］。目前，开设的常规基础实验可以有效地保证学生掌握微生物学基本实验技能，但要培养出双“一流”高校人才，还需注重培养学习兴趣和创新思维，重点提升分析解决问题的综合能力，因此有必要紧密结合前沿性科研成果，围绕微生物基本实验核心点，辐射发散至药理学、药物分析等多个实验方向，对实验教学内容进行扩充，形成辐射状的综合性教学模式，提升本科教学实验的纵横向饱满度。

随着分子生物学、肠道微生学等学科的迅速发展，肠道微生态与机体健康的研究也已经普及到食品［2］、化工［3］、医药［4］等多个领域，其作用也日益受到人们的关注与重视［5］，可以认为研究微生物／微生物群与其宿主的关系已成为现代应用微生物学的重要发展方向之一。因此开设围绕“健康”为主旨的微生物学综合实验在制药工程专业教学工作中具有一定的意义。

本综合性实验依托于学院肠道微生态的研究成果［6-12］，以一株前期分离得到的安全有效的益生菌［13-14］—罗伊氏乳杆菌为研究对象，由学生进行菌株观察与鉴定，应用肠道厌氧发酵模拟器-气相色谱对该菌株肠道“益生”作用进行定量评价，在小鼠肠道菌群失调模型上进行宏观考察。通过开设此综合性实验，不仅可以促进学生巩固经典微生物基本操作，掌握分子生物学、药物分析、药理学实验技能，还可提高学生创新思维和科研热情。

1 实验材料与仪器

1.1 实验材料

MRS培养基：胰蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母提取物5 g，葡萄糖20 g，柠檬酸二铵2 g，乙酸钠5 g，K2HPO42 g，MnSO4·4H2O 0.25 g（MnSO4·H2O 0.19 g），MgSO4·7H2O 0.58 g，吐温80 1 mL，蒸馏水1 L，121℃灭菌20 min。

发酵培养基（g／L）：KMOS 8.0、胰蛋白胨3.0、蛋白胨3.0、酵母提取物4.5、胆盐3 号0.4、L-半胱氨酸盐酸盐0.8、氯化铁血红素0.05、NaCl 4.5、KCl 2.5、MgCl2·6H2O 0.45、CaCl2·6H2O 0.2、KH2PO40.4、Tween80 1.0、微量元素（MgSO4·7H2O 3.0、MnCl2·4H2O 0.32、FeSO4·7H2O 0.1、CoSO4·7H2O 0.18、CaCl2·2H2O 0.1、ZnSO4·7H2O 0.18、CuSO4·5H2O 0.01、NiCl2·6H2O 0.092）2.0，pH 6.5，121 ℃湿热灭菌20 min。

10名健康志愿者粪便；罗伊氏乳杆菌为本实验室保存菌株；本实验中使用的细菌基因组提取试剂盒、PCR产物纯化试剂盒等均购上海生工；PCR过程中所用引物购于上海生工，PCR过程中所用酶及试剂均购自索莱宝生物；乙酸、丙酸、丁酸、戊酸（GC，纯度≥99.5%）购自阿拉丁试剂有限公司；其他试剂：分析纯，上海国药集团。

1.2 实验仪器

显微镜；酶标仪；PCR扩增仪；低速离心机；厌氧工作站（37℃，80% 二氧化碳，10% 氢气，10% 氮气）；酸度计；涡旋仪；高压蒸汽灭菌锅；金属浴；气相色谱仪；切片机；pH自动控制加液机。

1.3 实验动物

BALB／c小鼠，雌雄各半，体重18～22 g，由上海斯莱克实验动物责任有限公司提供，饲养温度（23±2）℃，相对湿度（50±5）%，自由进食和饮水，适应性饲养1周。

2 实验方法

2.1 菌株的生理生化鉴定

菌株活化后接入MRS培养基，37℃静置培养24 h，取少量菌液并适当稀释，涂布MRS平板，37℃厌氧培养48 h，于显微镜下观察细胞形态、生理生化鉴定。

2.2 16 S rDNA序列分析

用DNA提取试剂盒提取基因组DNA，采用细菌通用引物进行16 S rDNA的PCR扩增。PCR反应体系为25 μL：10 × PCR Buffer 2.5 μL，dNTPs 2.0 μL，上下游引物各0.5 μL，模板DNA 1.0 μL，ExTaq 酶0.25 μL，ddH2O 18.25 μL。PCR 反应条件：95 ℃ 预变性，2 min；循环过程为95℃变45 s，退火温度56℃，45 s，72℃延伸90 s，共进行30个循环；72℃终延伸10 min，4℃保持，共30个循环。PCR产物经电泳后回收纯化，送上海生工有限公司测序，测序结果在GenBank中进行BLAST比对，确定种属类别。

2.3 体外评价

2.3.1 肠道发酵器的搭建与稳定性评价

文献［15］方法：结合实际研究搭建模拟肠道发酵器（见图1），按照配方配置发酵培养基，高温灭菌后向系统中通入高纯氮气，控制系统的温度、搅拌速度、pH等，使其保持稳定。取新鲜的健康捐献者的粪便样品5 g，灭菌PBS制成20%（w／v）菌悬液，震荡混匀，离心（8 000 r／min，1 min）取上清，将上清液通过补料口接种到已经预运行48 h的发酵罐中，调节蠕动泵以输送新鲜培养基和废液，使发酵罐的液位恒定。PCRDGGE检测证明连续发酵的前期（0～8 d），系统中菌群波动较大，处于不稳定状态，当发酵进入第9、10 d后，DGGE图谱上条带相似度高，种类及丰富度基本没有变化，说明此时发酵器内的菌群处于稳定状态，UPGMA相似性聚类分析结果基本与DGGE结果一致。因此，本实验选择经发酵器连续厌氧发酵10 d后的稳定的肠道微生物群落为研究对象，研究罗伊氏乳杆菌的肠道调节作用。

2.3.2 实验组设计

以稳定恒化器中的肠道微生物菌群作为发酵系统，设置两组实验：对照组与罗伊氏乳杆菌组（接种量为1%），厌氧条件下连续培养36 h，取样检测。

2.3.3 SCFA 检测

图1 模拟肠道发酵器

文献［16-17］方法：取1 mL培养液，4℃，12 000 r／min下离心10 min除菌体。取500 μL上清，离心去除沉淀，加入1 mL乙醚萃取15 min，低温离心分离，取上清进样。精密称取乙酸、丙酸、丁酸、戊酸适量，加乙醚制成储备液，加入内标物（50 μg／mL），待进样。以标准物和内标物浓度比为横坐标，对应峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，用于计算待测物浓度。采用气相色谱法检测短链脂肪酸（Short Chain Fatty Acid，SCFA）含量，色谱柱：DB-WAX 30M（I.D.0.32 mm，5 μm）；升温程序：50℃保持3 min，以6℃／min升至120℃，保持0.5 min，以6℃／min升至220℃，保持5 min；载气（N2）流速3 mL／min，载气（H2）流速47 mL／min；空气流量400 mL／min；进样量1.0 μL；分流比1∶3。数据采用Origin 8软件作图，结果以平均值±标准差（mean±SD）表示。

2.4 样品处理

2.4.1 实验动物模型

1周的适应期后，小鼠随机分成3组，每组8只，取两组小鼠，连续7 d灌胃头孢曲松钠生理盐水溶液（1.25 mg／g bw）造模。将模型小鼠平均分为模型组和罗伊氏乳杆菌组两组，其中罗伊氏乳杆菌组连续15 d灌胃罗伊氏乳杆菌菌液（浓度为0.5×1010CFU／g bw）。模型组和对照组连续15 d灌胃等体积生理盐水。

2.4.2 实验动物及样品处理方法

实验定期进行称重并监测小鼠的摄食量，饮水量，记录数据，灌胃结束后将小鼠颈椎脱位处死，腹部75%乙醇消毒，解剖，取盲肠内容物测定SCFA，盲肠内容物取出后，PBS冲洗，4%多聚甲醛固定，75%乙醇脱水、石蜡包埋、切片、染色，显微镜下观察。

3 实验结果

3.1 菌株鉴定结果

显微镜下菌落为乳白色，不透明，湿润，中心不凸起，属于细菌。参照《伯杰氏细菌鉴定手册》对菌株分别进行生理生化鉴定，结果如表1所示。进一步分析生理生化鉴定结果可知，该菌株均能利用糖类物质生长，同时产酸，且大部分菌株对胆盐的耐受能力较强。以菌株的基因组为模板，PCR扩增长度为1.5 kb，该片段提交至GenBank中，与已报道的序列进行BLAST比对，比对结果最终确定本实验的试验菌为罗伊氏乳杆菌。

表1 菌株生理生化特征

3.2 体外肠道发酵器评价

SCFA是含1～6个碳原子的有机羧酸，是目前最常用的肠道微生态研究指标之一，其主要包含乙酸、丙酸、丁酸和戊酸［18］。现代药理学与临床研究表明，SCFA参与肠上皮细胞的能量供应，不仅可影响肠腔pH和电解质平衡、肠黏膜屏障的通透性、肠道高敏感和肠动力的调节，还与抗炎、抗肿瘤等密切相关。已有研究表明，不同种类SCFA的生理功能各有特点，如丁酸为肠道上皮细胞的主要能量来源，可通过激活氯离子／丁酸通道、促进钠离子／氢离子交换等途径促进肠道水与离子的吸收，改善腹泻情况［19-20］，此外，丁酸还可通过抑制组蛋白去乙酰化酶，抑制端粒酶活动，发挥抗肿瘤效应［21］；丙酸有助于保护肠黏膜屏障，通过STAT3信号通路减少炎症与氧化损伤［22］等。

不同组SCFA检测结果如表2所示。数据可见，外源添加罗伊氏乳杆菌对肠道SCFA产生的种类没有影响，但对含量有显著影响。相较于对照组，添加了罗伊氏乳杆菌后，丙酸、丁酸、戊酸含量分别显著增加了25.9、3及9倍，而乙酸未发生显著变化。体外实验结果表明，罗伊氏乳杆菌可影响肠道SCFA结构，从而发挥益生作用。

3.3 菌群失调模型建立及评价

3.3.1 体重检测结果

实验期间无小鼠死亡，各组小鼠饮水量与采食量无显著差异。对照组小鼠体重在实验期间无显著变化，而模型组和罗伊氏乳杆菌组小鼠在造模后体重均有所下降，经过15 d灌胃处理后两组体重均有所回升，但与对照组无显著差异。

表2 不同组SCFA的产生量

3.3.2 SCFA 检测结果

不同组小鼠肠道内SCFA含量检测结果如表3所示。数据可见，模型组小鼠肠道内SCFA含量显著降低，其中总酸含量从（68.15 ± 6.5）mmol／L 下降至（16.27 ±0.79）mmol／L，其中乙酸含量从（32.56 ±2.32）mmol／L 显著下降至（12.02 ±0.42）mmol／L，丁酸含量从（27.15 ±4.98）mmol／L 显著下降至（4.25 ±1.22）mmol／L，而丙酸与戊酸几乎检测不出。而与模型组相比，罗伊氏乳杆菌组小鼠肠道内总酸含量［（98.55 ±3.23）mmol／L］显著高于模型组［（16.27 ±0.79）mmol／L］，其中乙酸、丁酸、戊酸分别为（35.93±0.99），（26.07 ±4.08），（0.49 ± 0.10）mmol／L，与对照组无显著差异；与体外结果相一致的是丙酸含量增加最明显，为（36.05 ±4.41）mmol／L，显著高于对照组。分析可见，抗生素干扰小鼠肠道菌群平衡，造成了SCFA显著下降，而罗伊氏乳杆菌能够显著改善肠道环境，提高SCA的产量，但体内与体外的SCFA趋势结果不完全一致，这可能是由于体外只能实现小部分肠道微生物的培养，导致了体内外微生物菌群的差异。

表3 盲肠内容物SCFA含量 mmol／L

3.3.3 肠道组织形态观察

图2所示为随机抽取的盲肠组织切片光镜图，由图可见，对照组小鼠肠道上皮细胞完整，绒毛排列整齐，模型组肠上皮细胞破坏严重，肠绒毛缺损明显，排列紊乱，而经过罗伊氏乳杆菌干扰的小鼠肠上皮结构与对照组相近，肠绒毛排列整齐且致密。

图2 小鼠盲肠纵切面200×

表4所示为各组肠绒毛高度，数据显示模型组小鼠肠绒毛高度［（76.4 ±7.5）μm］相较于对照组［（149.7 ±4.5）μm］显著降低（P ＜0.05），经过罗伊氏乳杆菌干预的小鼠肠绒毛高度［（165.9±5.1）μm］较模型组甚至空白对照组都有显著增长（P＜0.05）。结果表明，罗伊氏乳杆菌能够在抗生素失调模型小鼠中发挥肠道保护作用。这可能是由于罗伊氏乳杆菌能够通过调节肠道SCFA的数量与结构，改善抗生素引起的肠黏膜损伤，促进肠绒毛的增长等［23］。

表4 各组小鼠盲肠绒毛高度

4 结 语

（1）菌株的培养鉴定实验可进一步巩固学生微生物的基本操作技能，在此基础上增加了常规的分子操作，拓宽了传统微生物实验课的视野，为学生进一步从事相关科研工作奠定了基础。

（2）以SCFA为定量指标，搭建了体外肠道模拟发酵器，提高微生物实验课堂的趣味性，该实验单元着重培养了学生对气相色谱、PCR等科研型仪器的操作能力。

（3）药理学技术等已在多学科领域得到全面普及，动物实验单元要求学生熟练掌握解剖、取样等技能以获取样本，进行关键性指标检测及常规病理切片，对培养学生综合实验技能和提高科研素养具有重要的意义。

（4）通过本实验项目的实施，有助于学生掌握精准化肠道微生态营养产品的开发与研究的一般方法与科研思路，为未来从事药学、食品、微生物学等领域相关工作奠定基础。