烤烟NC82和毕纳1号品种叶片数的遗传模式分析及分子标记筛选

蒲媛媛 郑宏斌 李显航 喻奇伟 熊晶 夏忠文 罗家俊 李星悦 陈谊然 刘仁祥

摘 要：為了提高烤烟品种NC82叶片数改良的效率，本研究选用与NC82叶片数差异显著的毕纳1号分别作为母本和父本，构建了P1、P2、F1、F2遗传研究材料，采用“主基因+多基因”遗传模型分析方法对烤烟叶片数进行了遗传分析，并筛选了烤烟叶片数分子标记。结果表明：烤烟叶片数为非胞质遗传，受2对主效基因与多基因共同影响，最适遗传模型为MX2-EA-AD，主基因+多基因遗传率为92%，主基因和多基因加性效应分别为-3.40、2.37;与叶片数连锁的标记为标记TM20490和TM10102，遗传距离分别是4.8cM和5.3cM。经过试验得知，烤烟叶片数为2对等加性主基因+加性-显性多基因控制的数量性状，主基因遗传率大，采用回交技术结合分子标记辅助选择可定向改良优质烤烟品种NC82的叶片数。

关键词：烤烟;叶片数;遗传分析;SSR分子标记

中图分类号：S572文献标识码：A

文章编号：1008-0457（2020）03-0017-06 国际DOI编码：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2020.03.003

The Genetic Analysig and Molecular Marker Screening of Leaf Number of Flue-cured Tobacco Varieries NC82 and Bina1

PU Yuanyuan.1，ZHENG Hongbin.2，LI Xianhang.1，YU Qiwei.3，XIONG Jing.3，XIA Zhongwen.3，LUO Jiajun.1，LI Xingyue.1，CHEN Yiran.1，LIU Renxiang.1 *

（1. College of Agriculture/Guizhou Key Laboratory of Tobacco Quality Research， Guizhou University， Guiyang， Guizhou 550025， China; 2.China Tobacco Zhejiang Industrial Company， Hangzhou， Zhejiang 310000，China; 3. Bijie Branch of Guizhou Tobacoo Company， Bijie， Guizhou 551700， China）

Abstract：In order to improve the efficiency of improving the leaf number of flue-cured tobacco varieties NC82， this paper selected Bina 1 with a significant difference from the NC82 leaf number as the female and the male parent， respectively， and constructed P1， P2， F1， F2 genetic research materials The "main gene + polygene" genetic model analysis method was used to genetically analyze the leaf number of flue-cured tobacco and screen molecular markers of the leaf number of flue-cured tobacco. The results showed that the leaf number of flue-cured tobacco was non-cytoplasmic， which was affected by two pairs of major genes and polygenes. The optimal genetic model was MX2-EA-AD， and the inheritance rate of major gene+poly gene was 92%， and the additive effects of that were -3.40 and 2.37， respectively. The markers associated with leaf number were TM20490 and TM10102， and the genetic distances were 4.8 cM and 5.3 cM， respectively. In words， the leaf number of flue-cured tobacco was a quantitative trait controlled by 2 equally additive main genes+additive-dominant polygenes， and the main gene has a high heritability. Backcrossing technology combined with molecular marker-assisted selection can be directed to improve the number of leaves of NC82， a high-quality flue-cured tobacco.

Keywords：flue-cured tobacco; leaf number; genetic analysis; SSR molecular markers

烤烟是一种叶用经济作物，叶片数是烟叶产量的主要构成指标之一，叶片数的多少直接影响烟农经济收益和卷烟原料市场的供应[1]。前人研究表明，烤烟叶片数遗传率高[2]，单株叶片数与烟叶产量呈极显著正相关[3-6]，对叶片性状的遗传分析结果表明，烤烟叶片数主要受基因加性效应的影响[7]，同是受多基因共同作用[8-9]。烤烟叶片数加性、显性效应在不同的发育阶段差异明显，其互作效应呈间断性表达[10]。SSR分子标记因均匀覆盖整个基因组，多态性高，操作简单，是常用的提高目标性状选择效率和可靠性的辅助选择方法，在烤烟分子标记研究方面，童治军[11]等利用DH群体发现了10个有效叶片数相关QTL，宋健[12]等利用F1和F2群体发现3个叶片数动态的QTL，李茜[13]利用SSR和SRAP分子标记技术发现2个与烤烟有效叶片数相关的QTL，冯吉等[14]利用SSR分子标记建立烟草抗TMV分子标记辅助选择育种体系，进一步加速抗TMV烤烟品种的培育，提高了烟草抗TMV的育种效率。本研究烤烟品种NC82品质好，但自然叶片数较少，限制了NC82在烟叶生产中的应用，改良NC82的叶片数对于促进该品种的应用有重要意义;毕纳1号是贵州省自育的烤烟品种，对贵州烟区的适应性强，自然叶片数在32片左右[15]。因此，选用叶片数差异显著的烤烟品种NC82和毕纳1号为亲本，构建P1、P2、F1、F2遗传研究材料，研究烤烟叶片数的遗传及其SSR分子标记，可为定向改良NC82的叶片数提供理论依据和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以NC82为母本、毕纳1号为父本，构建了P1、P2、正反交F1、F2共4个世代的遗传研究群体。

1.2 叶片数遗传研究

1.2.1 材料种植

所有试验材料于2018—2019年种植在贵州大学烟草育种科研基地。F2种植1600株，其他世代材料田间试验采用随机区组设计，三次重复，每小区三行，每行15株，株距为0.55m，行距为1.10m。其余栽培技术和田间管理方法按当地优质烤烟栽培技术方案实施。

1.2.2 叶片数的测定

参试材料烟株中心花开放时，按照烟草行业标准（YC/T 142-2010），测定所有烟株的叶片数。

1.2.3 叶片数遗传统计方法

采用Microsoft Excel 2016软件统计田间叶片數数据;利用SPSS 23.0统计分析软件进行叶片数差异显著性分析、正态检验、卡方检验，采用“主基因+多基因”遗传模型SEA软件对烤烟叶片数进行遗传模型选择、检验及遗传效应分析。根据本研究中的叶片数调查数据，计算极大似然函数值和AIC（Akaike's Information Criterion）值。选择相应的G4F2（P1、P2、F1和F2）世代遗传分析模型，依据最大熵值原则即AIC值最小的准则选择最佳候选模型，采用均匀性（U.21、U.22、U.23）、Smirnov（nW.2）和Kolmogorov（Dn）等3种适合性检验，根据检验结果选择统计量达到显著水平个数最少的模型为最优遗传模型。采用最小二乘法从最优遗传模型的各成分分布参数估计各基因效应值，分析各组合的遗传效应。

1.3 叶片数连锁SSR标记筛选

测定植株叶片数后，取参试材料烟株的幼嫩叶片提取基因组DNA;亲本和F1分别选取10株，F2全部按单株分别提取基因组DNA。DNA提取方法参照天根高效提取DNA试剂盒方法进行。采用琼脂糖凝胶电泳法和微量分光光度法检测DNA质量和浓度。参照BINDER等[12]和童治军[13]公布的烟草图谱SSR标记序列信息，从两张图谱中随机均匀选取了1000对引物，引物均由上海生工合成。PCR扩增体系为10μL体系（2xT5SuperPCRMix（PAGE）4μL，正向引物0.5μL反向引物0.5μL，模板DNA1μL，ddH2O 4μL）;扩增程序为：98℃预变性-98℃变性-58℃退火-72℃延伸，相应时间为3min、10s、10s、10s，共34个循环，然后72℃延伸2min。扩增产物用10%聚丙烯酰胺进行凝胶电泳，然后进行银染分析，采用“a、b、h”记录方法统计出现与亲本一致的带型，最后使用JoinMapv4.0进行连锁不平衡分析，筛选与烤烟叶片数紧密连锁标记，构建烤烟叶片数连锁分子标记图。

2 结果与分析

2.1 叶片数遗传分析

2.1.1 遗传类型分析

由表1可知，NC82平均叶片数为22.2片，毕纳1号平均叶片数为31片，相差8.8片，两者平均叶片数之间差异性极显著（P<0.01）。正、反交F1平均叶片数分别为24.5片和25.7片，两者之间差异不显著（P>0.05），说明叶片数为细胞核遗传，受细胞质遗传影响小。

由F2分离群体叶片数正态检验（图1）可知，F2分离群体偏离正态分布，说明叶片数遗传存在微效多基因作用。经卡方检验，卡方值6.05

2.1.2 叶片数最适遗传模型筛选

从表2、表3可知，MX2-EA-AD、MX2-AD-AD、MX2-A-AD、MX2-CD-AD、MX2-EAD-AD这5个模型的AIC值较小，作为备选模型。根据AIC准则，MX2-EA-AD模型的AIC值最小，为419.5469，MX2-EA-AD（2对等加性主基因+加性-显性多基因）模型即为最适遗传模型。

2.1.3 叶片数最适遗传模型的遗传参数

表4可知，最适模型MX2-EA-AD的群体平均数（m）为26.62，第1、2对主基因加性效应值（da（d））均为-3.40，多基因加性效应值[d]为2.37，多基因显性效应值[h]为-2.15，加性效应>显性效应。主基因遗传率为（h.2mg）87.41%，多基因遗传率（h.2pg）为4.37%，主基因+多基因遗传率（h.2mg+h.2pg）为91.78%。说明叶片数遗传率大，受父本毕纳1号影响较大，通过采用杂交育种、回交技术结合分子标记辅助选择，以毕纳1号为供体可定向改良优质烤烟品种NC82的叶片数。

2.2 叶片数SSR标记筛选

2.2.1 叶片数差异标记筛选

通过1000对SSR标记在亲本间初筛选，在亲本间共筛选出144对有差异且多态性、重复性和稳定性都较好标记。为较好控制叶片数遗传背景，消除遗传背景影响，在F2分离群体中随机挑选10株叶片数在19～22片和15株叶片数在31～34片的烟叶DNA，分别等量混合形成少叶、多叶叶片数的叶片数近等基因池，最后对亲本间有差异的144对SSR标记进行逐一筛选后表明，PT50001、TM10588、TM20490和TM10240 4对SSR标记在叶片数近等基因池扩增条带间具有差异。在少叶群体和多叶群体中分别挑选10株、20株……60株烟株，构建6个等梯度叶片数近等基因池，结果表明，4对标记在近等基因池数量为40株以上时扩增差异条带不明显，10～30株之间的近等基因池均能扩增出差异条带，说明在10～30株范围内构建叶片数近等基因池较好，4个标记与叶片数性状连锁。

2.2.2 F2分离群体SSR标记筛选

图2可看出，4对标记在F2分离群体的扩增条带清晰、主带明显，分离正常。采用“a、b、h”记录F2叶片数分离群体的扩增结果（表5），经c2检验（c2（2，0.05）=5.99），4对标记基因型分离比均符合3：1理论分离比，4对标记与叶片数性状相关。由已知的烟草遗传连锁标记图可知，PT50001位于第7染色体上，其他3个标记位于第4染色体上。连锁不平衡分析表明，TM10588、TM20490和TM10240 3对标记与叶片数性状紧密连锁，说明筛选到与烤烟叶片数连锁的TM10588、TM20490和TM10240 SSR标记。

2.2.3 叶片数分子标记连锁程度分析

由图3可知，以标记TM10588为起始点，TM20490和TM10102相对TM10588遗传距离分别为4.2cM和5.3cM，遗传距离均小于10cM，表明获得了与叶片数紧密连锁的TM20490和TM10102标记。

3 结论与讨论

大量研究表明，烟草叶片数属于多基因控制的数量性状[11，18-19]。本研究以NC82和毕纳1号为亲本，通过构建P1、P2、正反交F1、F2 4世代遗传研究群体，进行遗传分析表明，烤烟叶片数最适遗传模型为MX2-EA-AD，受2对等加性主基因+加性-显性多基因控制的性状，遗传以加性效应为主，加性效应大于显性效应，与牛佩兰等[10]和姚志敏等[20]研究结果类似，与张兴伟等[8]和许明辉等[19]研究结果存在差异，说明烤烟叶片数受主基因和多基因共同作用影响。本研究烤烟叶片数主基因遗传率（87.4107%）﹥多基因遗传率（4.3701%），与张兴伟等[8]研究结果一致，叶片数主要受主基因遗传控制，说明叶片数性状遗传以父本毕纳1号为主，可为NC82叶片数的改良提供优质有效的轮回亲本。

本研究利用SSR标记筛选到的4个（PT50001、TM10588、TM20490和TM10102）与烤烟叶片数连锁的标记，与童治军等[17，21]公布的12个叶片数的相关标记不一致（其中在2012年对烤烟产量相关的6个农艺性状进行QTL定位分析中检测到10个（TM10470、TM22123、TM10315a等）与叶片数相关的标记，2017年利用231份烤烟材料对其进行农艺性状和化学成分的关联分析，检测到2个（TM10846和PT607282）与叶数相关标记），标记产生差异的原因可能是所采用的亲本、以及所构建的遗传研究群体不同导致的。4个标记中TM20490和TM10102与叶片数基因紧密连锁，遗传距离分别为4.8cM和5.3cM，说明标记TM20490和TM10102与叶片数性状紧密连锁，与前人在烤烟抗病性方面的结论类似[14，22-23]。

本研究表明，烤烟叶片数为2对等加性主基因+加性-显性多基因控制的数量性状，主基因遗传率大，标记TM20490和TM10102与叶片数性状紧密连锁，采用回交技术结合分子标记辅助选择，可进一步提高选择准确性与选择效率，实现NC82的叶片数的定向改良。

参 考 文 献：

[1] 蒙芝.1978—2012年中国烤烟生产重心演变轨迹及其驱动机制研究[J].中国农业资源与区划，2015，36（4）：113-119.

[2] 徐航，刘仁祥，徐如宏，等.烤烟主要农艺性状的遗传分析[J].中国烟草科学，2013，34（5）：62-66.

[3] 焦芳婵，肖炳光，于海芹，等.烤烟主要农艺性状与产量的灰色关联度分析[J].湖南农业大学学报（自然科学版），2007（5）：564-567.

[4] 刘国侠，冉法芬，李云，等.皖南地区不同烤烟种质产量产值与农艺性状的相关分析[J].科技通报，2018，34（2）：46-50.

[5] LALITHA D D，LAKSHMINARAYANA R，ATLURI J B.Genetic variability and correlation studies on seed and other quantitative characters in Nicotiana tabacum L[J].Tobacco research，2002，28（2）：90-96.

[6] 刘洪祥.烤烟几个性状间相关性的初步分析[J].中国烟草科学，1980（2）：11-14.

[7] 黄平俊，欧阳花，易建华，等.烤烟叶片性状的遗传研究[J].云南农业大学学报，2009，24（6）：792-798，828.

[8] 张兴伟，王志德，任民，等.烤烟几个重要植物学性状的遗传分析[J].中国烟草科学，2012，33（5）：1-8.

[9] 张兴伟，王志德，孙玉合，等.烤烟叶数、叶面积的遗传分析[J].植物遗传资源学报，2012，13（3）：467-472.

[10] 姚志敏，张兴伟，向德虎，等.烤烟不同生育时期产量性状的遗传效应分析[J].植物遗传资源学报，2016，17（1）：105-113.

[11] 童治军，焦芳婵，陈学军，等.7个烤烟产量相关性状的QTL定位分析[J].西北植物学报，2018，38（7）：1235-1243.

[12] 宋健，刘国祥，佟英，等.不同发育时期烟草叶数和叶面积的QTL动态分析[J].分子植物育种，2019，17（18）：6047-6052.

[13] 李茜.烟草遗传图谱构建与农艺性状和化学成分的QTL定位[D].重庆：西南大学，2015.

[14] 冯吉，张俊杰，孙光伟，等.抗TMV烤烟育种高世代材料的分子标记辅助选择[J].烟草科技，2018，51（11）：8-13.

[15] 喻奇伟，翟欣，姜远泽，等.毕纳1号烤烟新品系的选育及特征特性研究[J].江西农业学报，2011，23（9）：15-17.

[16] BINDLER G，PLESKE J，BAKAHER N，et al.A high density genetic map of tobacco（Nicotiana tabacum L.）obtained from large scale microsatellite marker development[J].Theoretical and applied genetics，2011，123（2）：219-230.

[17] 童治軍.烟草微卫星标记的开发与应用[D].杭州：浙江大学，2012.

[18] 蔡长春，邓环，冯吉，等.烤烟生育期相关性状的初步遗传分析[J].中国烟草学报，2014，20（6）：70-77，84.

[19] 许明辉，王孟宇，龙文虹.烟草主要数量性状的遗传效应分析[J].遗传，2000（6）：395-397.

[20] 牛佩兰，佟道儒.影响烟草几个主要数量性状的最少基因数目估计[J].中国烟草科学，1989（4）：10-12.

[21] 童治军，陈学军，方敦煌，等.231份烤烟种质资源SSR标记遗传多样性及其与农艺性状和化学成分的关联分析[J].中国烟草学报，2017，23（5）：31-61.

[22] 范静苑.烟草黄瓜花叶病毒病抗性遗传分析及其分子标记[D].北京：中国农业科学院，2009.

[23] 徐秀红.烟草野火病的抗性鉴定及其抗性基因的分子标记与辅助选择[D].泰安：山东农业大学，2005.