大鼠脊髓背角Ⅱ、Ⅲ层神经元的高尔基染色特征*

邵采凤 赵明薇 陈 茜 杨 鲲，3△

（1 南通市中医院，南通大学附属南通中医院麻醉科，南通 226001；2 江苏大学医学院解剖学教研室，镇江 212013；3 Department of Neurology，School of Medicine，University of Maryland Baltimore 21201，USA）

脊髓背角是接受、调控并上传伤害性信息的初级门户[1]。按照Rexed分层，脊髓背角Ⅱ层为主要由中间神经元组成的半透明胶状质（substantia gelatinosa）[2]。曾长期认为Ⅱ层神经元以含γ-氨基丁酸（GABA）和/或甘氨酸（glycine）的抑制性中间神经元为主，但近年的研究表明，该层兴奋性中间神经元占多数[3]。因为Ⅱ层在痛觉研究中十分重要，研究人员曾用多种方法（尼氏染色、免疫组织化学、细胞内示踪剂注射、病毒示踪等）对其神经元的形态进行了观察[1，4]。意大利神经科学家卡米罗·高尔基（Camillo Golgi）于1870年发明的银染方法（高尔基染色法），一个半世纪后的今天仍是一种重要的神经解剖学基本方法[1，5]。高尔基染色法可以定性和定量地观察神经元的胞体及轴突和树突分支及走向，树突棘的形态和数量，其具体实验方法至今仍然在被不断地创新发展[5-8]。20世纪70～90年代有人利用高尔基染色将Ⅱ层神经元分为岛细胞（islet cell）和柄细胞（stalked cell），实验标本涉及了猫、大鼠、灵长类等[4，9-13]。位于Ⅱ层腹侧的Ⅲ层神经元主要由较大细胞组成，也参与伤害性信息的调控[4]，其树突表达与伤害性信息传递有关的P物质（substance P， SP）受体并以“容积传导”（volume transmission）方式接受终止于Ⅰ、Ⅱ层的初级传入末梢SP的释放[14]。Beal等[13]首次报道直接在同一切片上观察Ⅱ、Ⅲ层神经元的高尔基染色，分析了猕猴脊髓腰膨大节段胶状复合体（gelatinosal complex， 包括脊髓Ⅱ层和Ⅲ层）的高尔基染色特点，发现此相邻2层都显示多种形态特征的胞体和突起，且层界限模糊。该文将上述结果与Gobel在猫的Ⅱ层的研究[9]相比较，认为猕猴和猫可能因为物种不同而导致不同结果（Gobel报告称猫的Ⅱ层与邻层形态结构明显不同）。大鼠是常用实验动物，因此有必要直接比较大鼠脊髓Ⅱ、Ⅲ层高尔基染色特征。鉴于此，本研究在参考前人研究的基础上，进行成年大鼠脊髓腰段高尔基染色，并在冠状和矢状面观察Ⅱ层及其相邻的Ⅲ层神经元的染色结果，同时总结其突起走向。

1 材料和方法

1.1 实验动物

采用成年SD大鼠7只，雌雄不限（江苏大学实验动物中心或马里兰大学医学院动物中心提供），年龄5～8周，体质量180 g～220 g。标准实验动物饲养条件下（22℃～25℃），保持正常的昼夜生物节律，动物可自由摄取水和食物）饲养。高尔基染色试剂盒（FD Rapid GolgiStainTMKit）购自FD NeuroTechnologies， Inc. （美国马里兰州Catonsville），用于Golgi-Cox染色。

1.2 高尔基染色及方法

将大鼠用异氟烷吸入麻醉后，断头，行脊柱椎板切除术，暴露胸下部至腰骶部脊髓，细心摘出将其放置于冷的人工脑脊液内，于解剖镜下剥离蛛网膜和软脊膜，修去多余节段，保留第1腰椎～第2骶椎（L1～S2）节段。按照产品说明书步骤行高尔基染色：（1）双蒸水涤荡洗去多余脑脊液后置于浸染液（A液B液混合；分别为重铬酸钾和氯化汞）10 d，室温下避光保存，其中浸染第1个6 h后和次日各更新液体1次；（2）将标本转移至C液（含铬酸钾），4℃避光保存48 h～7 d；第1个6 h更新溶液；（3）染色结束后沉入含15%甘油（体积比）+ 20%蔗糖（质量比）的双蒸水24 h；（4）用冷冻切片包埋剂OCT （Sakura Tissue-Tek）包埋并冷冻，恒冷箱切片机（Leica CM1950）于-20℃～-22℃箱内切成厚度为100 μm的冠状或矢状片；（5）将切片按顺序裱于挂明胶的载玻片上，室温下自然晾干（防尘避光）。脱水（50%、75%、95%乙醇各4 min，最后于100%乙醇4次，每次4 min）、透明（二甲苯3次，各4 min）；（6）以中性树胶封片剂（Permount TM mounting medium）封片，显微镜下观片。

1.3 信息采集

冠状切片按Rexed分层法将脊髓灰质分层，矢状切取最大高度片。根据立体定位图谱和实际测量，无论冠状切或矢状切，均从背侧表面向腹内侧20～100 μm处 为Ⅱ层，再 向 腹 内 侧40 μm为Ⅲ层。在徕卡DMRX型光学显微镜下观察，利用QCapture 6.0版软件进行观片、分析，图像采集并保存为tif格式文件。主要观察：（1）轴突和树突的分支特点；（2）树突上树突棘的特点（有无、密度）；（3）突起的跨层特征等。

1.4 统计学处理

利用Graphpad Prism 6 （Graphpad Software， 美国加州San Diego）做统计分析。计量数据以x±s表示，行t检验。

2 结果

在冠状切脊髓可见飞蝶状灰质，无论冠状面或矢状面，各层均有高尔基染色阳性神经元，以Ⅲ～Ⅵ层最为密集（图1A1、B1）。高倍镜下可见Ⅱ层神经元细胞胞体较小，直径为（14.5±0.9）μm （n=13个神经元；来自7只大鼠，每只最多2个神经元）；其与Ⅲ层之间界限不明显，此结果和大鼠活体脑薄片有明确界限不同。这些差异可能是因为在冠状切面上，2层细胞的突起在腹背方向或/和内外侧方向表达结果类似[13]。Ⅱ层神经元有的局限于本层内（即位于表面开始向腹内侧20～100 μm范围内），也有神经元树突伸向内或外侧并超过胶状质范围。而Ⅲ层神经元胞体直径（21.8±1.7）μm（n=12个神经元；来自7只大鼠，每只最多2个神经元）较Ⅱ层显著增大（P＜ 0.01）。高倍镜下进一步分析，可见Ⅱ层神经元银染胞体数量相对较少，棘突密度不一，数量为（2.27±0.45）个/10 μm树突。部分神经元突起有较丰富的棘突[每10 μm树突多于2个，（3.65±0.54）个；n=7]（图1C1）；部分神经元突起较光滑，棘突稀疏[每10 μm树突少于或等于2个，（1.2±0.7）个；n=6](图1C2），提示Ⅱ层神经元可能在接受和调制伤害性信息上有不同功能。

与冠状面结果不同，在矢状切面可见Ⅱ层内着色神经元数量较Ⅲ层少，边界清晰（图1B1）；吻尾方向有较多的该层神经元突起且较长（有1例自胞体发出后，跟踪长度达550 μm）；突起上多见棘突（4.86±0.69）个/10 μm树突（图1C3），较Ⅱ层神经元的平均棘突数量为多（P＜0.01）。同冠状面的结果，Ⅲ层神经元的胞体在矢状切上也较Ⅱ层大（图1D），有向背侧发出的轴突穿过Ⅱ层（图1B2）。

图1 大鼠脊髓灰质的高尔基染色Fig 1 Golgi-staining of the gray matter in the spinal cord

3 讨论

20世纪70年代，在Rexed分层的基础上，Gobel在其系列高尔基染色工作中，将三叉神经脊束核的胶状质（Ⅱ层）神经元按照胞体和突起特征分为岛细胞、柄细胞和其他细胞3类；前2类占绝大多数，而不能归为这2类的则命名为“其他细胞”[9-10]；由此奠定了Ⅱ层神经元分类的基础[9]。参照Gobel方法，Todd和Lewis在大鼠的脊髓胶状质观察到突起局限于胶状质层的岛细胞及柄细胞各占染色阳性的细胞总数约1/3[11]。本研究在成年大鼠的冠状和矢状面上观察了Ⅱ、Ⅲ层脊髓背角神经元的高尔基染色，比较了Ⅱ、Ⅲ层着色神经元的胞体大小、突起分布等特性。结果表明，Ⅱ层神经元的胞体较Ⅲ层小，有的细胞轴突缺乏丰富的棘突，可能对应为岛细胞[11]；Ⅱ层突起在腹背侧方向和吻尾方向均较多；而Ⅲ层神经元在腹背侧和吻尾侧也均较多，结果与上述研究基本一致，进一步直接比较了Ⅱ、Ⅲ层在同一条件下（同一张切片）的高尔基染色特征。Ⅱ、Ⅲ层神经元的高尔基染色特征在棘突多寡和胞体直径上均有不同。

高尔基染色法在早期研究中确立了神经元轮廓及突起的行走方向等神经细胞的基本构架，在细胞内辣根过氧化物酶、生物素、荧光标记法出现的时代，高尔基染色法仍然是重要的神经解剖学手段[1，15-16]。但其方法不稳定，不易掌握。本实验验证了商品化高尔基染色试剂盒可以得到理想染色结果。特别需要指出的是，取材时组织是否需要固定，各家报道有差别，本实验没有经心冲洗血液，也未用固定液处理，但也得到理想效果，说明富含过氧化物酶的血液红细胞对高尔基染色结果影响不大。既往针对脊髓背角特别是Ⅱ层细胞的研究，已经证实Ⅱ层神经元具有多种多样的形态学及电生理学特性[8，17-18]。结合其他报道，本实验观察到的神经元与胞内注射取得的结果一致，但高尔基染色法可同时显示多个神经元，更适合同时观察多个神经细胞的分布和树突轴突走向。

Ⅲ层神经元在结构上和Ⅱ层有某些类似，但主要接受初级传入的有髓纤维[1]。尼氏染色显示Ⅲ层神经元数量实际上少于Ⅱ层[1]，然而本实验中观察到在矢状切面上Ⅱ层反而较稀疏，2个结果的差异可能是由高尔基染色的特点引起的：高尔基染色只能浸染少数神经元，正是这个特点使得高尔基染色法可以在“厚片”上获得少数浸染细胞而利于追踪突起走向和轴突上细小的棘突；但高尔基染色实验中何种细胞可被浸染，至今机制仍不明确[1，5]。本实验结果也提示在利用高尔基染色法时要注意其染色特点。本研究观察到Ⅱ层和Ⅲ层细胞的差异也提示此2层神经元在参与伤害性信息的传递和调控中可能扮演不同角色[2，17]。