十五种中药与吡嗪酰胺联合抗牛结核杆菌的体外实验

谢宗会，蒋昌河，万成杰，张春菁，杨再昌*

0 引言

结核病主要是由结核分枝杆菌引起的慢性传染病，根据世界卫生组织《2019年结核病报告》，结核病仍是全球十大死亡原因之一，2018年全球新发结核病患者约1 000万[1]。吡嗪酰胺是一种重要的一线抗结核病药物，使用吡嗪酰胺可使结核治疗时间由9个月缩短到6个月[2]，该药可渗透入吞噬细胞，并进入结核分枝杆菌菌体内，菌体内的酰胺酶使其脱去酰胺基转化为吡嗪酸而发挥抗菌作用；吡嗪酰胺可以杀死存在于酸性环境中的半休眠菌群[3]，在pH值为5～5.5时对结核分枝杆菌抑制作用最强，在人体中的最低抑菌浓度为12.5 μg/ml，当浓度达到50 μg/ml时，可以在体内直接杀死结核分枝杆菌[4]。本实验是在中性条件下进行的。

异烟肼对代谢旺盛的结核菌具有强大的杀菌作用，但是不能杀死代谢静止期的结核杆菌，而吡嗪酰胺对静止期的结核杆菌有杀菌作用[5]，因此，吡嗪酰胺在结核治疗中具有不可替代的作用。然而，在临床应用中吡嗪酰胺存在明显的缺点，与其他一线抗结核杆菌药物相比(如异烟肼，其体外MIC值为0.061 μg/ml)，吡嗪酰胺的体外MIC值(50～120 μg/ml)高，必须大剂量给药才能发挥治疗作用，相关研究表明，长期大剂量服用吡嗪酰胺会导致明显的肝毒性，若不及时进行保肝治疗可导致患者死亡[5-6]。因此，寻找能够增强吡嗪酰胺活性的分子对结核治疗具有重要意义，这类分子一方面可能对吡嗪酰胺的杀菌活性起增强或协同作用，另一方面能减少吡嗪酰胺的用药量，从而降低吡嗪酰胺的肝毒性。

在古代医药典籍中，结核称为“尸疰”、“鬼疰”、“痨瘵”、“肺痨”等，《肘后备疾方》里记载桑白皮、车前子、柴胡、当归治疗尸疰、鬼疰，《卫生宝鉴》记载乌梅治肺瘵，《世医得效方》记载地黄、茯苓治痨瘵，《医宗金鉴》记载赤芍、桂枝治肺痨，偏方“二麻四仁汤”治肺痨，方中杏仁为主药，文献报道大黄、木香、三棱、莪术、苍术对结核能发挥一定治疗作用[7-10]。基于上述文献记载和报道，选择桑白皮、桂枝、车前子、地黄、乌梅、茯苓、大黄、苦杏仁、当归、柴胡、木香、京三棱、苍术、莪术、赤芍共15种中药作为试验药材，采用改良罗氏培养基绝对浓度法，体外测试了15种中药醇提物与吡嗪酰胺的协同抗结核杆菌活性。

1 材料与方法

1.1 试验药物 桑白皮、桂枝、车前子、地黄、乌梅、茯苓、大黄、杏仁、当归、柴胡、木香、京三棱、苍术、莪术、赤芍购自贵阳市中药材公司；吡嗪酰胺购自百灵威科技有限公司。

1.2 菌株及培养基 所用试验菌株为牛结核分枝杆菌BCG菌株，购自ATCC(ATCC35734)。

1.3 试剂 常规化学试剂(均为分析纯)购自天津市致远化学试剂有限公司；改良罗氏培养基，购自上海博微生物科技有限公司。

1.4 仪器 旋转蒸发仪，型号R-3，瑞士Buchi公司；桌上式垂直净化工作台，型号VD-650，佰辉公司；普通电热套，型号DRT-4，北京市光明医疗仪器厂；高速多功能粉碎机，型号WJX-100，上海缘沃工贸有限公司。

1.5 实验方法

1.5.1 中药材提取物的制备 取桑白皮、桂枝、车前子、地黄、乌梅、茯苓、大黄、杏仁、当归、柴胡、木香、京三棱、苍术、莪术、赤芍15种中药材，分别粉碎至20目左右的粗粉，用75%的乙醇萃取，按照药材与乙醇1∶5的比例放入1 000 ml的圆底烧瓶里，采用热回流法提取3次，每次1 h，合并提取液，减压回收乙醇后，置蒸发皿蒸干，得到15种中药材乙醇提取物，置冰箱保存备用。

1.5.2 吡嗪酰胺抑菌活性测定 改良罗氏培养基40.84 g，加入12 ml甘油，加蒸馏水600 ml煮沸5～10 min，115 ℃灭菌20 min，待冷却至55 ℃左右加入1 000 ml搅匀的全蛋液，混匀，分装在15 mm×150 mm的试管，每管5 ml[11](置于烘箱中高温灭菌1 h)。称取一定量的吡嗪酰胺，用二甲基亚砜溶解，制成10 mg/ml的母液，高压灭菌后用微量进样器加入上述改良罗氏培养基中，得到吡嗪酰胺浓度分别为60、120、240、480、960 μg/ml的含药培养基，每个浓度做3管。阴性对照组为只加二甲基亚砜(<0.5%)的无药培养基。试管放置成斜面，在80 ℃的凝固器中灭菌1 h。待培养基冷至室温，每管分别接种牛结核分枝杆菌悬液50 μl (106CFU/ml)。接种后的试管放入恒温培养箱中，37 ℃培养20 d后观察结果。抑菌试验结果判定如下：菌落数低于8个(含8个)计为有抑菌活性。其中，无菌落生长计“+ + + +”，1～2个菌落计“+ + +”，3～5个菌落计“+ +”，6～8个菌落计“+”，菌落数超过8个视为无抑菌活性，计“-”。

1.5.3 中草药醇提物抑菌活性测定 15种中草药乙醇提取物均用二甲基亚砜溶解，加入改良罗氏培养基中，除桂枝醇提物浓度为0.5 mg/ml外，其余14种中药醇提物的终浓度均为1 mg/ml，每个样本做3管，空白对照组为只加二甲基亚砜的培养基。其余同上法。

1.5.4 吡嗪酰胺与15种中草药醇提物的联合抑菌试验 按上述方法制备同时含吡嗪酰胺和中草药醇提物的含药斜面培养基，吡嗪酰胺的终浓度为60 μg/ml，除桂枝醇提物浓度为0.5 mg/ml外，其余14种中药醇提物的终浓度均为1 mg/ml，按上法灭菌、接种、培养和进行结果判断。

2 结果

2.1 吡嗪酰胺抑菌活性结果 吡嗪酰胺的抑菌作用见表1，测出吡嗪酰胺对牛结核杆菌的最小抑菌浓度(MIC)为120 μg/ml。

表1 吡嗪酰胺对牛结核杆菌的体外抑菌活性(μg/ml)

2.2 15种中药乙醇提取物及与吡嗪酰胺联合的抗菌测试结果 15种中药乙醇提取物及与吡嗪酰胺联合的抑菌作用见表2。预试验发现，桂枝醇提物为1 mg/ml时，具有抑制牛结核杆菌的作用，故在联合抗菌试验时，将其浓度降至0.5 mg/ml，其余14种中药醇提物在1 mg/ml均无抗牛结核杆菌活性。从表2看出，共9种中药与吡嗪酰胺存在联合抗菌作用，按照抑菌强度，依次为桂枝、桑白皮、乌梅、茯苓、大黄、当归、柴胡、木香、莪术。

表2 15种中药乙醇提取物及与吡嗪酰胺联合对牛结核杆菌的体外抑菌活性

3 讨论

分枝杆菌属(Mycobacterium)包含不同种类的分枝杆菌，其中结核杆菌分为人型结核分枝杆菌和牛型结核分枝杆菌，这两类分枝杆菌可在人和牛之间交叉感染。出于生物安全考虑，国内外研究机构在筛选抗结核杆菌药物时，一般采用牛结核杆菌BCG菌株或人结核杆菌H37Ra无毒株进行初筛[12]。

吡嗪酰胺是一种前药，在结核杆菌内被转化成吡嗪酸，在pH 5.5的酸性环境中产生杀菌作用[13]。体外抗人型结核杆菌试验，在中性环境中吡嗪酰胺抑制人型结核杆菌的MIC值为100 μg/ml[12]。本实验测出吡嗪酰胺在中性环境中抗牛结核杆菌的最小抑菌浓度为120 μg/ml。异烟肼体外抑制牛结核杆菌的MIC值为0.06～0.12 μg/ml，与异烟肼比较，结核杆菌不管是人型还是牛型，对吡嗪酰胺都缺乏敏感性。因此，将牛结核杆菌作为试验菌株，对筛选能增强吡嗪酰胺抑菌作用的中草药是恰当的。

当吡嗪酰胺浓度降低到60 μg/ml时，牛结核杆菌生长良好，在同等浓度(60 μg/ml)含吡嗪酰胺的培养基中分别再加入桂枝、桑白皮、乌梅、茯苓、大黄、当归、柴胡、木香、莪术的醇提物后，牛结核杆菌的生长完全被抑制，表明这9种中药能增强吡嗪酰胺的抗菌作用。后续工作中，拟采用活性跟踪分离方法对桂枝、桑白皮、乌梅等中药进行深入研究，分离、鉴定与吡嗪酰胺具有协同抗菌作用的活性分子，为发现新型抗结核杆菌药物奠定基础。