结核分枝杆菌对吡嗪酰胺耐药的相关基因及耐药机制研究进展

周婷婷 郑小曼 欧阳净 鲁雁秋 陈耀凯

结核病是结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)感染所引起的一种传染性疾病，是全球十大死因之一，2020年全球新发结核病患者987万例，发病率为127/10万[1]。结核病治疗和管理在全球范围内面临着MTB多药耐药日益严峻的挑战。作为烟酰胺的一种衍生物，吡嗪酰胺自1952年被发现具有抑菌活性后就一直被用于结核病的治疗，具有不可替代的优势。研究发现，吡嗪酰胺被动扩散进入MTB胞内后，在吡嗪酰胺酶作用下活化为吡嗪酸，当MTB所处环境为低pH值条件时会促进吡嗪酸在菌内的累积，聚集的吡嗪酸破坏了胞内正常的酸碱平衡从而导致细胞死亡，表现为吡嗪酰胺的抗菌作用[2]。吡嗪酰胺在降低结核病复发率、缩短病程，以及治疗异烟肼和利福平耐药患者方面都发挥关键作用[3]。此外，在体外低pH值条件下，其他一线抗结核药物效果不佳时，吡嗪酰胺仍对半休眠期MTB和持留菌具有较好的杀菌作用[4]。

然而，越来越多研究表明，MTB对吡嗪酰胺的耐药性呈明显上升趋势[5]，其耐药性主要是由于一些靶标基因突变产生的，包括编码吡嗪酰胺酶的pncA基因、编码30S核糖体蛋白质S1的rpsA基因、编码天门冬氨酸脱羧酶的panD基因等。另外，部分研究发现Ⅰ型脂肪酸合成酶FAS-I基因突变、长链脂酰辅酶A连接酶D2编码基因fadD2突变与MTB对吡嗪酰胺的耐药性也存在一定联系。笔者结合最新文献，对几种可能与吡嗪酰胺耐药性相关的靶标基因及其研究进展进行综述。

一、吡嗪酰胺耐药相关基因及其机制

(一)pncA

pncA基因长558 bp，编码186个氨基酸，最终转录翻译为吡嗪酰胺酶。在MTB对吡嗪酰胺耐药有关的基因突变中，pncA基因突变种类最丰富且位点不固定，包括大部分的点突变和少数的碱基插入或缺失突变，部分菌株中pncA在不止一个位点均有突变。因此，pncA突变也被认为是MTB对吡嗪酰胺耐药的分子基础[6]。Yadon等[7]在体外实验和动物模型中对MTB的pncA突变进行了筛选，发现了300多个pncA突变，这些突变导致吡嗪酰胺酶活性损失或吡嗪酰胺酶蛋白质丰度降低；Li等[8]利用大肠杆菌pncA基因敲除菌株测试了30个新发现的pncA突变对吡嗪酰胺酶活性的影响，结果表明，这些新突变中的24个导致吡嗪酰胺酶的活性丧失。这些研究都表明，pncA的突变使吡嗪酰胺在细胞内转变成有活性的吡嗪酸效率受损，进而使该菌株具有吡嗪酰胺耐药性。

Ei等[9]对192株MTB进行吡嗪酰胺药物敏感性试验和pncA测序分析，在82株分离株的pncA启动子区发现65个不同的突变。Naluyange等[10]报道了K96R、T142R、R154G和V180F的突变，这些pncA的突变均使MTB表现出对吡嗪酰胺的耐药性，而吡嗪酰胺敏感菌株的测序结果则显示pncA及启动子区均未发生突变；Wu等[11]在一些中国耐药株中发现pncA基因一些位点的突变率超过5%，这些突变位点包括第10位谷氨酰胺(Gln)突变为脯氨酸(Pro)，第12位天冬氨酸(Asp)突变为丙氨酸(Ala)，第41位酪氨酸(Tyr)突变为终止子，第97位甘氨酸(Gly)突变为天冬氨酸(Asp)，第128位缬氨酸(Val)突变为甘氨酸(Gly)和第131位FSC的突变。

虽然pncA基因突变的位点几乎无规律可寻，分散于整个基因范围内，但Katale等[12]研究发现，有42.1%的突变发生在第128位，表现为缬氨酸(Val)突变为甘氨酸(Gly)。Aggarwal等[13]发现由pncA突变引起的吡嗪酰胺酶突变结构(W68R，W68G)和天然吡嗪酰胺酶蛋白相比，与底物的亲和力更低，分子动力学模拟分析表明，吡嗪酰胺酶第68个残基突变会导致其活性位点发生结构变化，进而影响蛋白质的生物学功能，即吡嗪酰胺向吡嗪酸的转化，表现为MTB的吡嗪酰胺抗性。

(二)rpsA

rpsA基因全长1446 bp，编码的30S核糖体蛋白质S1(RpsA)含有481个氨基酸。rpsA的突变率介于pncA和panD之间，是吡嗪酰胺耐药基因突变第二大高发基因[14]。RpsA是一种重要的参与核糖体转录和蛋白质翻译过程的蛋白质。Shi等[15]认为吡嗪酸的新靶标是RpsA，即吡嗪酸与RpsA结合并与RpsA的天然辅助因子tmRNA竞争，从而抑制活性蛋白质合成所需要的反式翻译，影响MTB的活性蛋白合成，进而达到杀菌作用。之后，该研究者对1株缺乏pncA突变的吡嗪酰胺低水平耐药MTB临床分离株DHM444(最低抑菌浓度为200～300 mg/ml 吡嗪酰胺)的rpsA基因进行了序列测定，发现其在RpsA蛋白的C末端含有DA438缺失，进一步高效表达并纯化了突变体RpsA DA438蛋白，发现与野生型H37Rv RpsA蛋白不同，它不与吡嗪酸结合；对不同分枝杆菌菌种RpsA蛋白序列进行比对，结果显示，耐吡嗪酰胺的DHM444菌株中DA438缺失发生的C-末端区域也是吡嗪酰胺敏感菌株和耐药菌株间差异最大的区域，表明该区域的变化可能改变吡嗪酰胺的易感性[15]。另外，他们还发现，吡嗪酰胺对翻译过程的抑制可能会干扰MTB在应激、胁迫条件下的存活能力。这一发现有助于解释不同应激条件下，如酸性pH值、低氧、饥饿、存在能量抑制剂和其他药物，都可增强吡嗪酰胺的灭菌活性；也有助于解释吡嗪酸与RpsA结合并抑制反式翻译过程[15]。

然而，Dillon等[16]的研究则提出MTB中的活性RpsA与RNA单链相互作用，并非是吡嗪酸的靶标。此外，他们还发现，一些在吡嗪酰胺抗性菌株中发现的rpsA突变株，在实验室进行菌株中重建时并不会表现出吡嗪酰胺抗性；利用纯化的MTB核糖体进行体外反转录实验时发现一种干扰寡核苷酸可以抑制菌体反转录，而吡嗪酸却不能。基于这些实验，Dillon等[16]认为吡嗪酰胺在MTB中的作用机制与RpsA和MTB自身的转录翻译无关。Vallejos-Sanchez等[17]也认为RpsA可能不参与MTB中吡嗪酰胺的作用机制，他们评估了吡嗪酸与tmRNA竞争RpsA的能力，结果显示吡嗪酸和RpsA无论是在MTB野生型还是rpsA突变株中都没有观测到相关结合，表明RpsA可能不参与MTB中吡嗪酰胺的作用机制。

(三)panD

panD基因全长420 bp，转录翻译成吡嗪酸的靶标——139个氨基酸组成的天冬氨酸脱羧酶PanD[18]。泛酸和辅酶A(CoA)是MTB正常生理代谢所不可或缺的，panD参与泛酸和CoA生物合成前体β-丙氨酸的合成[19]，由此推测panD突变可能会影响泛酸和CoA的生物合成，进而影响MTB对吡嗪酰胺的敏感性。Shi等[20]对一些在pncA和rpsA中没有突变的吡嗪酸抗性突变体进行测序分析，发现吡嗪酸抗性突变体均具有影响panD蛋白C末端的突变，其中PanD M117I是最常见的突变。过表达PanD M117I会赋予MTB对吡嗪酸和吡嗪酰胺的抗性。此外，在治疗浓度下，吡嗪酸的浓度与MTB中PanD酶的活性呈负相关，但前药吡嗪酰胺或吡嗪酰胺类似物烟酰胺并未抑制其活性。这些发现也同样表明PanD可能是吡嗪酰胺/吡嗪酸的新靶标[20]。

近期也有报道指出吡嗪酸可能只是一种微弱的PanD酶抑制剂。Gopal等[21]通过圆二色谱分析发现吡嗪酸可以改变PanD的二级结构和四级结构，他们进一步指出PanD是酪蛋白水解酶ClpC1-ClpP的底物，吡嗪酸通过促进ClpC1-ClpP降解其靶标PanD来阻止MTB正常CoA的生物合成，从而表现为吡嗪酰胺通过降解目标蛋白质发挥抗菌活性。最近的分子动力学研究发现，PanD酶在其活性位点上以一种竞争性抑制的方式结合吡嗪酸，但PanD酶活性位点不能直接结合抑制剂，而panD突变导致PanD酶蛋白质构象发生变化，促进PanD酶活性位点与吡嗪酸结合进而使菌株产生耐药，这些耐药突变多聚集在PanD酶活性部位上方的环附近，这些抗性突变体通常会表现出较低耐药性[22]。Pandey等[23]研究发现，panD基因非活性位点H21R、I49V的突变会造成MTB对吡嗪酰胺耐药，该研究通过分子动力学模拟，证实了H21R-I49V的双突变影响了PanD与吡嗪酰胺复合体的结构，与天然蛋白相比，双突变体对吡嗪酰胺的结合亲和力更低、在配体结合位点上结构变化更多，表明panD基因非活性位点突变可能也与MTB的耐药机制相关。

(四) 其他基因

fadD2基因长1683 bp，编码长链脂肪酸酰辅酶A连接酶(FadD2)。研究报道，fadD2功能的正常发挥可能有助于MTB对吡嗪酰胺和吡嗪酸表现出耐药性，FadD2功能丧失可将MTB对吡嗪酰胺和吡嗪酸的敏感性增强16倍，表明fadD2基因可能是MTB天然携带的而非后天突变获得的耐药基因[24]。值得注意的是，该报道还发现FadD2功能缺失的突变体在中性pH条件(pH=6.8)下对吡嗪酰胺敏感，而在相同条件下观察到野生型MTB却对吡嗪酰胺的高度耐受[24]。从机制上讲，fadD2表达中断引起的脂质代谢紊乱可能使MTB在转录水平上进行某种程度的代谢重编程，这一发现同时也提示，吡嗪酰胺的作用机制可能不是完全依赖酸性环境的[24]。虽然目前大多认为fadD2基因与MTB中CoA和脂质代谢联系密切，但仍缺乏大量研究以确定fadD2具体如何调控MTB的吡嗪酰胺耐药机制。

FAS-I基因编码脂肪酸合成酶I(FAS-I)，后者是α6亚型的蛋白质复合物，由6条长多肽链组成，总相对分子质量约为2 000 000。每个FAS-I的α链有7个催化结构域，由3069个氨基酸组成。FAS-I不仅调控MTB的脂肪酸合成代谢，也是MTB毒性的关键酶复合体[25]。Elad等[25]利用分子建模和单粒子冷冻电镜技术发现，尽管FAS-I总体结构相似，但MTB的FAS-I具有与其他细菌FAS-I系统静电势不同且结构域之间的间隙更大。FAS-I产生的C26脂肪酸是构成MTB自身重要耐药细胞膜屏障——分枝菌酸的前体物质，考虑到靶向抑制分枝菌酸的合成是一种有效杀灭MTB的方法，因此，FAS-I基因是抗结核药物的研究主要靶点之一。当吡嗪酸在MTB内聚集时会抑制FAS-I的活性进而破坏细胞膜的正常点位、影响菌体的能量代谢，从而发挥对MTB一定程度上的抑制性[26]。有研究发现吡嗪酸的类似物5-氯吡嗪酰胺是NADPH与FAS-I结合的竞争性抑制剂，能够抑制FAS-I的活性[27]。

二、总结与展望

随着分子生物学技术的飞速发展，对于MTB的吡嗪酰胺耐药性相关分子机制的研究也突飞猛进。结合分子动力学分析MTB相关蛋白质空间结构、活性位点的变化也大大提升了相关基因耐药机制的研究水平。近期研究发现，在吡嗪酰胺耐药株中大多数为pncA突变，突变率约为90%，其次为rpsA，突变率约为7%～10%，最后为panD突变，突变率约为1%～3%[28]。虽然相关耐药分子机制的探索一直在不断进行当中，但无论是pncA、rpsA、panD、fadD2还是FAS-I，目前尚无任何一个相关耐药基因的分子机制能够被完全阐述清楚，且rpsA和panD是否与MTB的吡嗪酰胺耐药性有明显相关性目前仍存在一些争议。关于FAS-I基因突变、fadD2基因突变的研究较少，因此上述相关基因都还需要大量的实验数据支撑以继续探究。另外，有些菌株基因测序结果显示无相关耐药基因突变，但仍可表现出一定的抗性[29]，部分耐药基因不同位点的突变所导致的MTB的耐药性也不相同[8]，这些现象从一定程度上提示MTB对吡嗪酰胺的耐药还存在一些其他机制或未知的基因突变有待深入研究。

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