骨髓增殖性肿瘤患者不同预后与DNMT3A、MPL W515、JAK2 exon12基因突变的分析

何 瑛，魏学花

骨髓增殖性肿瘤(MPN)是以骨髓造血干细胞的过度增殖为主要特征的恶性肿瘤之一[1]，其主要包括慢性粒细胞白血病、真性红细胞增多症、原发性血小板增多症以及原发性骨髓纤维化[2]。目前对于骨髓增殖性肿瘤疾病的发病机制尚不明确，随着基因测序手段的不断提升，越来越多研究显示，骨髓增殖性肿瘤与多种基因的突变相关[3]。DNA甲基转移酶3A(DNMT3A)与组蛋白以及DNA的合成具有重要的作用，DNMT3A基因突变存在于多种恶性血液病中，且参与恶性血液病的发生、发展。MPL W515对于调控DNA的修饰具有重要作用，MPL W515突变可继发激活JAK-STAT等信号转导通路，引起MPN发生。JAK2 exon12突变与肿瘤的进展以及增殖具有重要联系。研究报道显示[4]，DNMT3A、MPL W515、JAK2 exon12基因的突变与骨髓增殖性肿瘤患者的危险层级相关，同时根据患者的基因突变以及危险分级，及时采取相应的干预措施，可提升患者的治疗效果，本研究通过对MPN患者DNMT3A、MPL W515、JAK2 exon12基因突变率、突变类型的检测，分析其与预后的关系，为临床治疗奠定基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料：本次研究对象均来自于2010年2月-2015年4月在银川市第一人民医院治疗的骨髓增殖性肿瘤患者，共120例，其中，男性57例，女性63例；50岁以下27例，51～60岁51例，61～70岁42例；病程0～2年59例，3～5年61例.根据世界卫生组织(WHO)诊断以及分类标准，真性红细胞增多症(PV)患者31例，原发性血小板增多症(ET)患者29例，原发性骨髓纤维化(PMF)患者12例，慢性髓性白血病患者(CML)48例；根据核型分析结果显示，预后良好组患者56例，中度风险组患者42例，不良风险组患者22例。本研究经银川市第一人民医院伦理委员会批准，所有患者或其家属均对此次研究知情且签署知情同意书。

纳入标准：①所有患者均符合骨髓增殖性肿瘤诊断标准[5]；②所有患者入院前均未进行抗肿瘤治疗；③患者均未有肿瘤远处转移；④已获得患者及家属知情同意。排除标准：①严重心脏、肝、肾功能障碍的患者；②入院前3个月内服用过糖皮质激素或受体拮抗剂类药物；③中途停止治疗或者转院患者。

1.2 研究方法：基因检测，分别对所有患者采集外周血4 mL，3 500 r/min离心15 min，弃去上清液，加入等体积的异丙醇，以Trizol试剂进行总RNA提取，以PCR方法进行扩增，DNMT3A检测上游引物设定为5′-TACATCTGGCTACTGGGTGTCGTATC-3′，下游引物设定为：5′-TCGCAGGGTCCGAGGTATTC-3′，MPL W515检测的上游引物设定为5′-CCGCTCGAGCCCTCCCCCAAAC-3′，下游引物设定为5′-GAATGCGGCCGCCTGGGAGTGGTAAAAGGGGAGGAT-3′，JAK2 exon12上游引物设定为5′-ACACTCCAGCTGGGTGGATTTTTGG-3′，以5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3为下游引物，采用半巢式聚合酶链式反应连接的限制性片段长度多态性分析方法对患者样本的基因进行突变分型。

1.3 观察指标

1.3.1 不同预后风险患者的基础资料比较：分别对预后良好组患者、中度风险组患者、不良风险组患者的性别、临床类型、年龄、血脂情况、糖尿病、高血压患病情况进行比较。

1.3.2 不同预后组患者基因突变情况分析：分别对预后良好组患者、中度风险组患者、不良风险组患者的DNMT3A、MPL W515、JAK2 exon12基因突变的差异分析。

1.3.3 不同生存期患者的基因突变情况分析：分别对患者开展5年的生存分析，比较生存患者与死亡患者的DNMT3A、MPL W515、JAK2 exon12基因突变的差异。

1.3.4 患者的DNMT3A、MPL W515、JAK2 exon12基因突变与生存情况、预后风险之间的相关性分析：采用spearman相关性分析，对患者的DNMT3A、MPL W515、JAK2 exon12基因突变与生存情况、预后风险之间的相关性分析。

2 结果

2.1 不同预后风险患者的基础资料比较：分别对不同预后组患者的基础资料进行比较，不同预后组患者的性别、年龄、疾病类型、BMI、慢性病患病情况之间的差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 不同预后风险患者的基础资料比较

2.2 不同预后组患者基因突变情况分析：随着不良预后风险的增高，患者的DNMT3A、MPL W515、JAK2 exon12基因突变率显著增高，差异有统计学意义(P<0.05)。不良预后组患者的DNMT3A、MPL W515、JAK2 exon12基因突变类型主要表现为TT、AT以及GG基因的突变，见表2。

表2 不同预后组患者基因突变的分布[n(%)]

2.3 不同生存期患者的基因突变率分析：通过对患者的5年的生存分析，生存患者90例，死亡患者30例，通过对患者不同生存期患者的基因突变情况分析，死亡组患者的DNMT3A、MPL W515、JAK2 exon12基因突变率显著高于生存组(P<0.05)。而在患者的基因突变型的分析中，死亡组患者的DNMT3A、MPL W515、JAK2 exon12基因突变主要表现为TT基因型的突变，见表3。

表3 不同生存期患者的基因突变分布[n(%)]

2.4 DNMT3A、MPL W515、JAK2 exon12基因突变与生存情况、预后风险之间的相关性：患者的DNMT3A、MPL W515、JAK2 exon12基因突变与生存情况、预后风险呈现正相关(P<0.05)，见表4。

表4 DNMT3A、MPL W515、JAK2 exon12基因突变与生存情况、预后风险之间的相关性分析

3 讨论

骨髓增殖性肿瘤是患者的造血干细胞在分化过程中的异常增殖，造成患者的异质性基因突变性疾病。随着患者的疾病恶化，患者可能逐步发展为骨髓纤维化，最终导致白血病的发生[6]。有流行病学调查显示[7]，骨髓增殖性肿瘤疾病的生存情况不一，可在数月到20年之间。骨髓增殖性肿瘤疾病的发病机制以及预后的评价因素分析，有研究报道指出[8]，患者的疾病类型、年龄、细胞遗传学以及核酸物质的差异均可导致患者的生存以及预后的差异。目前对于骨髓增殖性肿瘤患者的基因突变诊断已经成为疾病诊断的特异性指标之一，同时也是作为临床靶向治疗的研究重点。近年来随着基因测序手段的不断发展，骨髓增殖性肿瘤患者的发病基因已经发现越来越多的相关性[9]。众多研究指出[10-11]，基因的突变不仅是骨髓增殖性肿瘤的疾病进展的标志，同时也可作为患者的不同预后的重要指标。

本研究中，通过对患者的预后以及生存情况的分析显示，在不同预后组及不同生存期组患者中，DNMT3A、MPL W515、JAK2 exon12基因突变的发生率有显著差异，随着预后不良风险升高，患者的DNMT3A、MPL W515、JAK2 exon12基因突变的发生率有显著增加，死亡组患者的DNMT3A、MPL W515、JAK2 exon12基因突变率显著高于生存组，DNMT3A、MPL W515、JAK2 exon12基因突变率与生存情况、预后风险呈现正相关。分析认为，DNMT3A基因与DNA的甲基化显著相关，对于肿瘤相关基因的调节以及转录具有显著的沉默作用。在以往的研究中发现[12]，单一的DNMT3A基因突变并不会造成患者的疾病进展，但是也有研究发现[13]，患者的DNMT3A基因突变不属于单一事件的发生，往往与影响患者疾病进展的多种基因的突变相互影响，进而造成疾病的进展。JAK2是造成骨髓增殖性肿瘤患者进展的关键性因素，是JAK家族的重要成员之一，而JAK家族是对肿瘤细胞转录具有指导性作用。通过JAK-STAT途径对患者的细胞表面多种受体，特别是细胞因子的信号通路受体的调控，对肿瘤细胞的增殖以及分化进行调节，而JAK2 exon12基因作为JAK2基因的亚型，同样对患者的肿瘤细胞的增殖分化具有重要的调控作用。随着该基因的失控、变异，患者的肿瘤细胞的调节受到严重干扰，肿瘤细胞呈现无序生长，进而表现为肿瘤疾病的进展以及生存期的缩短。而MPL W515基因的突变已经被世界卫生组织列为骨髓增殖性肿瘤的特异性诊断依据，该基因的突变主要是通过对患者的MPL/TPOR跨膜运动中的色氨酸进行改变，将其替换为亮氨酸或赖氨酸，进而导致突变的细胞对于细胞因子的依赖性降低，进而发生异常增殖现象，同时有研究报道指出[14]，其对于JAK-STAT途径的转导具有显著的激活作用，进而刺激疾病的进展，所以从分子生物学的分析显示，三种基因的突变并不是相互独立，而是相互影响，进而促使患者的疾病进展。张叶华等[15]通过对骨髓增殖性肿瘤患者的DNMT3A基因突变与疾病的预后分析显示，随着患者DNMT3A基因突变率的升高，患者的不良预后风险显著升高。何志鹏等[16]通过对患者的JAK2 exon12基因突变与骨髓增殖性肿瘤发展为白血病的风险研究，患者的白血病转化率与患者的JAK2 exon12基因突变情况呈现正相关。王怡斐等[17]通过对患者的骨髓增殖性细胞的MPL W515基因的突变与疾病的诊断分析显示，患者的该基因突变发生率与患者的危险分层相关，与本研究相互印证。

综上所述，骨髓增殖性肿瘤患者DNMT3A、MPL W515、JAK2 exon12基因突变可能与患者的预后相关，未来可作为患者诊断与治疗的重要靶点。