温度对芦笋秸秆水解发酵的影响*

燕 燕，崔铭昊，徐苏云

（1.平湖市农业生态能源站，浙江 平湖 314200；2.上海理工大学环境与建筑学院，上海 200093）

1 引言

芦笋属于百合科天门冬属，为多年生宿根植物，别名为龙须菜、石刁柏等。芦笋茎可以分为鳞芽、地上茎和地下根状茎3 个部分，其鳞芽嫩茎生长到一定高度时可采摘作为蔬菜食用［1］。芦笋的食用部分为嫩茎，约占茎总长度的1/2～2/3，剩余的木质化部分，即老茎则成为收割时的废弃物［2］；纤维素、半纤维素和木质素占芦笋秸秆总量的50%以上［3］。利用秸秆类有机固废发酵生产腐植酸（Humic acid），既可减少环境污染，又可得到高附加值的生化黄腐酸产品，从而提高秸秆的资源化利用率［4］。

腐植酸是生物有机质在微生物的分解转化下，经过长期的反应和积累而得到的一类结构功能十分复杂的混合物［2］。可按不同溶解性将其进行分类，其中黄腐酸（Fulvic acid，又称富里酸） 是最具活性的一种成分，分子量小、渗透能力强、易被生物吸收利用［4-5］。黄腐酸应用于农业种植，能改良土壤、增强肥效、增加产量、提高作物抗病力和改善果实品质［6］。微生物发酵生产生化黄腐酸工艺以固体发酵和液体发酵为主，固体发酵后需采用NaOH 等碱液浸出发酵产物中的腐植酸，液体发酵产物可就近作为液体肥料直接施入土壤［4］。比较而言，液体发酵更易实现连续化运行和工艺参数调控，有望缩短发酵周期。

多种微生物具有降解纤维素和半纤维素的能力，如假单胞菌属（Pseudomonas）、色杆菌属（Chrom obacterium）、芽孢杆菌属（Bacillus）、纤维弧菌属（Cellibrio） 中的一些细菌，以及木霉（Trichoderma）、青霉（Penicllium） 等多种真菌［7］。李艳［8］研究指出，有机物料与微生物是腐殖质形成的重要物质基础，不同微生物对不同有机物料的利用程度直接关系到腐殖化的效果及腐殖质组分的组成与结构，如木质素等通过分解和氧化产生的醌型化合物、蛋白质产生的氨基酸均为构成腐殖质的主要前体物质，微生物对葡萄糖的腐殖化是合成过程，对纤维素的腐殖化则经历了降解再合成阶段。真菌可能在细胞内形成醌或其他芳香族化合物，在分泌到体外以及细胞自溶时很容易缩合-聚合成腐殖质；链霉菌中的灰褐链霉菌、球孢链霉菌分别能够促进黄腐酸、腐植酸的形成［7］。

以减量化为目标的生物处理，大多关注秸秆水解过程中基质的消耗速率，而对水解过程中腐殖质类物质的产生和转化研究较少。刘陶［6］研究表明，发酵菌种类别及接种量、氮源及其添加量等均会影响液体发酵黄腐酸产量。发酵温度是影响水解发酵进程的一项重要参数，陈广银等［9］研究指出，提高温度对秸秆纤维素与木质素的水解溶出有利。实际上，温度对发酵产物的腐殖化转化也将产生重要影响，高温条件下可分解利用水解产物的微生物活性可能提高，造成试验后期水解产物的大量损失，导致腐殖质前体物质浓度降低、减少腐植酸产量，因而有必要针对不同基质种类的腐殖化过程进行温度条件优化。目前相关研究多基于固态发酵或堆肥过程中腐殖化进程开展，而关于水解发酵过程中腐殖化转化的影响机制的报道较少。因此本研究以芦笋秸秆为底物，对比了不同发酵温度对芦笋秸秆水解效率以及腐殖化过程的影响，以期提高黄腐酸的产率。

2 材料和方法

2.1 原材料和接种物

以浙江平湖某农场的芦笋老茎为研究对象。芦笋老茎含水量为91.1%，挥发性固体（VS） 与总固体（TS） 的比值为94.4%，干固体纤维素含量为27.1%。水解菌剂购自湖北启明生物工程有限公司（有机肥料腐熟剂），混合菌剂包括芽孢杆菌（Bacillus subtillis，＞90%）、放线菌、酵母菌和丝状真菌，1 g 菌剂中约含有活菌5×1010个，以CMC-Na 液体培养基测试该菌剂的纤维素酶活性为43.02 U/g，表明该菌剂具有较高的纤维素水解能力。芦笋秸秆理化性质见表1。

表1 芦笋秸秆理化性质

2.2 试验设置

研究以1 L 锥形瓶作为水解发酵装置，每组投加300 g 芦笋老茎（颗粒粒径＜1 cm）、300 mL 去离子水，按芦笋老茎质量比0.3%接种菌剂，各添加1%尿素作为氮源补充，共设置4 个温度处理组：25、35、45、55 ℃。每组设置两个平行试验，水解发酵持续16 d。试验过程中，每2 d 取10 mL 的混合物样品，将混合物样品以10 000 r/min 离心6 min，然后用0.45 μm 过滤器过滤后储存上清液待测。

2.3 分析方法

所采集的液体样品的溶解态总有机碳（TOC）浓度，采用TOC 分析仪（Jena/3100） 检测；挥发性有机酸（VFAs） 浓度采用气相色谱（Agilent GC7890B，安捷伦科技有限公司，美国） 测定；蛋白质浓度采用考马斯亮蓝G-250 分光光度法测定；多糖浓度采用苯酚硫酸分光光度法测定；黄腐酸浓度采用容量滴定法测量［10］。在水解前后分别取固体样品测定TS 和纤维素含量，并计算得到总固体降解率和纤维素降解率，固体TS 和VS 采用重量法分析，纤维素含量采用重铬酸钾氧化法测定。纤维素降解率计算公式如下：

式中：R 代表芦笋秸秆的纤维素降解率，%；c0和c1分别代表水解前后的纤维素含量，mg/g；TS0和TS1分别代表芦笋秸秆水解前后的含固率，%。

水解液中溶解性有机物组分采用三维荧光光谱仪（3D-EEM，日本日立F-7000FL） 表征，将荧光数据进行处理计算得到腐殖化指数（HIX） 和荧光指数（FI）［11］，计算方式如下：

式中：Ex 表示激发波长，nm；Em 表示发射波长，nm。

3 结果和讨论

3.1 固体分解效率

图1 所示为各试验组的TS 和纤维素降解率。经过16 d 的水解，各试验组的TS 降解率依次为：49.5%（35℃） ＜51.4%（25 ℃） ＜55.4%（45 ℃） ＜59.2%（55 ℃）。试验结果表明当水解温度为55 ℃时，水解系统对TS 具有较高的去除率，比35 ℃组的TS 降解率高出9.7 个百分点，比25℃组高出7.8 个百分点。水解结束时，各试验组纤维素降解率依次为19.6% （25 ℃） ＜22.1% （35 ℃） ＜25.6%（45 ℃） ＜32.1%（55 ℃），表明纤维素降解率与温度呈正相关。接种菌剂以枯草芽孢杆菌为主，说明该菌种对高温条件耐受能力较好，其分泌的纤维素酶活性能在55 ℃条件下实现更高的纤维素分解效率［5，10］。纤维素降解率高于TS 降解率，可能是由基质的有机物结构和菌种微生物种类造成的，芦笋秸秆随收割时间延后而逐渐木质化，水解环境下木质素的降解相对纤维素要困难［4］；研究表明，真菌和放线菌对木质素的降解效果更佳［7］，本研究采用的水解发酵菌剂主要为枯草芽孢杆菌，对木质素的降解能力有限，从而限制了整体干固体物质的降解效率。

图1 不同水解温度条件下秸秆TS 降解率和纤维素降解率变化趋势

3.2 水解过程中黄腐酸浓度变化

水解发酵过程中黄腐酸浓度变化如图2 所示。

图2 水解发酵过程中黄腐酸浓度变化

水解液中黄腐酸的浓度随发酵时间的延长而增加，高温条件下黄腐酸浓度趋于稳定的速度更快且最终黄腐酸产量水平更高。在发酵13 d 以后，45 ℃和55 ℃试验组的黄腐酸产量增速放缓并逐渐趋于稳定，45 ℃试验组黄腐酸产量从6 034 mg/L（13 d） 增加至6 335 mg/L（16 d），增幅为5.0%；55 ℃试验组黄腐酸产量从7 210 mg/L（13 d） 增加至7 320 mg/L（16d），增幅仅为1.5%。而温度为25℃和35 ℃的两个试验组黄腐酸浓度在水解中后期仍逐步升高。经过16 d 发酵后得到的黄腐酸浓度分别为4 498 mg/L（25 ℃）＜4 792 mg/L（35 ℃）＜6 335 mg/L（45 ℃）＜7 320 mg/L（55 ℃），说明中高温条件更有利于黄腐酸的合成。

3.3 水解液中有机物浓度变化

芦笋秸秆水解过程中，水解液中各有机物成分的浓度变化如图3 所示。水解初期，水溶性TOC 含量随温度升高而增大，第2 天的TOC 浓度较初始值分别增加了9.7%、21.9%、22.9%、33.3%，这可能是由于高温条件具有更好的TOC 增溶效果，这与前人的研究结果一致［12-13］。45 ℃和55 ℃的两个试验组在水解第2 天的多糖浓度增幅明显，比初始值分别增加了27.9%、29.9%；而35℃和25℃两个试验组在相同时间点的多糖含量并未出现明显上浮，而是逐渐下降。第2～13天，TOC 和蛋白质、多糖都随反应进行而逐渐下降， 55 ℃试验组蛋白质和多糖的下降速率更快，与此同时黄腐酸浓度的同期增幅更高，说明多糖的初期增溶可能对黄腐酸合成起到促进作用。在水解的中后期阶段，55 ℃试验组呈现出较高的多糖和蛋白质去除率，这也与水溶性TOC 的结果相对应。

芦笋秸秆发酵初期，因大量水溶性有机质的释放，代谢中间产物的小分子有机酸（以丙酸、丁酸、戊酸为主） 迅速生成并在体系积累，如图3所示，VFAs 浓度与TOC 同步大幅升高；而后，由于试验研究采用了非封闭兼氧体系，接种物中需氧微生物可进一步将VFAs 转化为CO2，或利用VFAs 与其他中间产物发生生物聚合，因此随着发酵的进行，VFAs 浓度逐渐下降。45 ℃和55 ℃试验组的VFAs 浓度峰值出现在水解第2 天，而25 ℃和35 ℃两个试验组的VFAs 浓度峰值稍有滞后，出现在第4 天；试验结束时，55 ℃试验组的VFAs水平最低（约为2 380 mg/L）。若体系严重酸化，会对微生物活性造成负面影响，进而抑制水解发酵的进程［7］。丁杰等［14］指出，有机质在微生物的作用下分解为小分子的碳水化合物（包括小分子有机酸），其经过微生物的生化循环途径形成酚、醌类物质，这些物质是合成腐殖质类物质的前体，因此有机酸产生的同时会加快腐殖质代谢速率，使二者处于动态平衡状态，对腐殖化具有促进作用。本试验结果表明，提高水解温度可以缩短产酸时间、减少体系的酸积累，有利于水解发酵体系的稳定以及后期的腐殖化进程。

3.4 水解过程的腐殖化程度变化

图4 为三维荧光图谱处理计算所得水解液中3D-EEM 各区域荧光强度变化趋势。图4 中的I、II 和III 区为类蛋白物质的主要荧光峰，其荧光强度均随着水解发酵的进行而降低；Ⅳ区（Ex 为310～360 nm，Em 为370～450 nm） 为FA 荧光峰，各试验组IV 区荧光强度随发酵时间延长而增加，说明类腐殖质类物质开始逐渐出现。

图4 水解液中3D-EEM 各区域荧光强度变化趋势

HIX 指数代表HA/FA 比值，通常HIX 指数越高代表腐殖化程度越高［15］，常应用在好氧堆肥过程中评价堆肥腐殖化水平，反映堆肥腐殖质组分性质的变化［16］。由图5 可知，在水解结束时各试验组HIX 指数达到最大，分别为0.54（25 ℃） ＜0.61（35 ℃） ＜1.05（45 ℃） ＜1.47（55 ℃）。温度为55 ℃时，水解中期HIX 指数提升最快，在水解的第8 天达到1.23 并趋于稳定；而45 ℃的试验组在第13 天趋于稳定。中温两组HIX 指数较低，与黄腐酸浓度的变化相对应。

FI 指数用于表征荧光DOM 中腐殖成分的来源。当FI＞1.9 时，主要为水溶性和自身微生物源，自发源特征较为明显；当FI＜1.3 时，主要来源于土地和土壤输入，自生贡献较少［17］。由图5可知，4 个试验组的FI 指数在水解中期均大于1.9，说明各组荧光DOM 的来源均来自微生物的活动，其中，温度为55 ℃的试验组的FI 指数在3 左右，表明高温条件下荧光DOM 的自生来源特性更加强烈，这可能是源于更高的微生物活性［17］。

图5 水解液中HIX 指数、FI 指数变化趋势

李艳［8］研究表明，枯草芽孢杆菌处理的纤维素H/C、（O+S）/C 及（N+O）/C 比值相对基质纤维素的比值降低，说明产物的分子缩合度增大、结构更复杂，即枯草芽孢杆菌降解纤维素后还能继续合成大分子复杂有机物。曹云等［18］研究表明，超高温预处理可促进大分子有机物降解为可溶性有机碳，促进了木质纤维素组分降解溶出、更多的多酚产出，同时增加了腐殖质前体还原糖、氨基酸的含量，从而有利于腐殖质的生成。综合图2～5 所反映的水解液组分变化，可得出：高温条件有利于纤维素等组分的水解，在水解初期增加了腐殖质前体多糖、蛋白质等成分的释放，从而有效促进腐殖化进程。

4 结论

1） 水解温度的升高有利于有机物大分子水解溶出，经过16 d 水解后，55 ℃水解系统得到更高的TS 和纤维素去除率，分别为59.2%和32.1%；

2） 55 ℃试验组在水解初期有较高的TOC 和多糖溶出，促进黄腐酸和其他腐殖质类物质的合成，从而加快水解系统的稳定化进程、缩短反应周期。