云南普洱三种茶叶提取物对黑色素瘤细胞增殖影响及抑菌效果的研究

姬国杰，刘婷威，王朋博，刘 瑞，田存章，贺新平，沈宇杰，胡焕焕

（1.新乡医学院三全学院生物与基础医学实验教学中心；2.新乡医学院生命科学技术学院；3.新乡医学院三全学院生命科学技术学院，河南 新乡 453000）

茶为山茶科植物茶（Camellia Sinensi Kuntze）的芽叶，含有多种功能性成分，如茶多酚、茶色素、茶多糖、茶皂素等，对人体具有多方面的保健功效［1-2］。不仅可以具有消炎、抗自由基、抗突变、降血压、抗氧化、抗衰老、抗辐射、防治心血管疾病、防癌抗癌、调节免疫等多种功效，还具有广谱、强效的抑菌作用［1-3］。被应用于食品、饲料、化妆品、医药等多个领域［4］。

茶多酚（Tea Polyphenol，TP）是茶叶中多酚类物质的总称，又叫茶单宁或茶鞣质，主要包括黄烷醇（儿茶素）类、黄酮类、黄酮醇类、花色苷类和酚酸类等，其中儿茶素占60%～80%［5］。茶多酚是茶叶中有保健功能的主要成份之一［6-9］，茶多酚因其独特的药理性质备受关注［10］。近年来，关于茶叶中的提取物茶多酚的抑菌活性也有很多报道［11-12］，但茶叶的产地不同，加工和制作方法不同其内在成分也会有所变化，其抑菌效果也不同。

黑色素瘤（Malignant melanoma，MM）是一种来源于黑色素细胞异常增生引起，是一种恶性程度较高的皮肤肿瘤，转移发生早，预后效果差，晚期和有远端转移的患者平均生存期仅有6～10个月［13］。多发于30岁以上的成年人，偶尔可见于儿童。恶性黑色素瘤在过去几十年里全球发病率逐渐提高，占所有皮肤癌的5%［14］。全部皮肤癌死亡人数中的75%都为恶性黑色素瘤患者，每年全球约有13.2万恶性黑色素瘤患者［15-16］。

本研究选用产自云南普洱红螺红茶、碧螺春绿茶和紫芽普洱茶（生茶）3 种茶叶，通过水浸提方法提取茶叶中主要成分，并比较不同茶叶水提物对黑色素瘤细胞增殖的影响及对大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的抑菌效果。以期为茶叶抗肿瘤及抑菌效果进一步研究提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 茶叶红螺红茶（产品标准号：GB/T 13738.2，生产许可证编号：SC11445112100245，生产日期：2019-6-14）、碧螺春绿茶（产品标准号：GB/T14456.3，生产许可证编号：SC11434020805122，2019-3-10）、紫芽普洱茶生茶（产品标准号：GB/T22111，生产许可证编号：SC11453082411272，2019-4-26），等级：一级，产地：云南普洱。

1.1.2 细胞及菌种B16 细胞，本实验室液氮罐保存。大肠杆菌ATCC 8099（Escherichia coli），购自北京陆桥技术有限责任公司；金黄色葡萄球菌ATCC 29213（Staphyloccocus aureus），购自南京便诊生物科技有限公司。

1.1.3 主要试剂及仪器胎牛血清（美国Thermo）；2.5%胰蛋白酶、RPMI Medium 1640 培养基（索莱宝）；CCK-8 试剂（碧云天）；CO2培养箱（Heracell 150i，美国Thermo）；倒置显微镜（IM-5，美国Thermo）；细胞计数仪（Countstar BioTech，上海睿钰科技）；酶联免疫检测仪（Multiskan FC，美国Thermo）；高压灭菌锅（MJ-78A，施都凯仪器）；双人双面超净工作台（SW-CJ-2F，苏州净化）；恒温培养振荡器（ZHWY-2102C，上海智城）；电子分析天平（FA2204B，上海精科天美）。

1.2 实验方法

1.2.1 茶叶提取物的制备参考GB/T8303-2002的方法（进行修改）进行提取，3种茶叶分别称取20 g，用400 mL 煮沸的超纯水在100 ℃水浴锅中水浴浸提1 h，每10 min 摇1 次，过滤、洗涤残渣后自然冷却，滤液于500 mL容量瓶定容。旋转蒸发仪真空浓缩（55 ℃，真空度0.9 MPa）至50 mL，茶叶提取物浓度为400 mg·mL-1。无菌条件下过滤，备用。

1.2.2 细胞培养黑色素瘤细胞用含有10%胎牛血清的RPMI Medium 1640 培养基于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，取对数生长期细胞用于实验。

1.2.3 CCK-8 检测细胞增殖的影响取对数生长期黑色素瘤细胞，调整细胞浓度以1×104个/mL，接种在96 孔培养板中，CO2培养箱中培养过夜。显微镜下观察细胞铺满孔底60%即可添加茶叶提取物。实验组添加茶叶提取物，对照组添加等量培养基。置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h、48 h，吸取上清液后加入CCK-8（10 μL/孔），37 ℃、5%CO2培养箱中孵育3 h 后，酶标仪读取吸光度（A 值），检测波长450 nm。

抑制率=（加药组细胞平均吸光度/对照组细胞平均吸光值－1）×100%

1.2.4 菌悬液制备将试验所用的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌分别接种于LB 培养基平板上，37 ℃培养箱培养18～24 h 活化菌株，挑取单菌落于LB液体培养基中，37 ℃摇床培养18～24 h，调整菌体浓度1×107CFU·mL-1，备用。

1.2.5 药敏片的制备用6 mm的手动打孔器制作直径6 mm 的圆形滤纸片60 个，分为5 组分别放入3种茶叶浸提物溶液、无菌水和80 μg·mL-1青霉素溶液中，无菌条件下浸泡12 h。然后放入电热干燥箱中，40 ℃烘干备用。

1.2.6 茶叶提取物抑菌活性研究在培养皿上均匀涂布100 μL 不同菌悬液，干燥后，将药敏纸片贴在对应的平板上。37 ℃恒温培养箱，培养18～24 h。培养后用游标卡尺测定抑菌圈大小，抑菌圈试验判定标准为：抑菌环直径＞20 mm 为极敏；15～20 mm为高 敏；10～15 mm 为中敏；7～9 mm 为低敏；＜7 mm 为不敏感。以无菌水、青霉素对照，重复3次，取平均值。

2 结 果

2.1 不同茶叶提取物对黑色素瘤细胞增殖的影响由图1可知：3种茶叶提取物对黑色素瘤细胞的生长都有一定的抑制效果，紫芽普洱茶（生茶）＞碧螺春绿茶＞红螺红茶。

图1 不同茶叶提取物对黑色素瘤细胞的抑制效果

2.2 不同茶叶提取物的抑菌效果从表1可知：对2 种供试菌，3 种茶叶提取物的抑菌效果为，紫芽普洱茶（生茶）＞碧螺春绿茶＞红螺红茶，同一种茶叶提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌效果要优于大肠杆菌。参考NCCLS 推荐的标准进行判断，在不同茶叶浸提液实验浓度下，大肠杆菌对红螺红茶，对碧螺春绿茶中敏，对紫芽普洱茶生茶（生茶）高敏；金黄色葡萄球菌对红螺红茶高敏，对碧螺春绿茶、紫芽普洱茶生茶（生茶）极敏。

表1 不同茶叶提取物对2种供试菌的抑菌效果/mm

3 讨 论

茶多酚是茶叶中多酚类物质的总称，现代生理药理学研究表明，茶多酚具有止渴提神、延缓衰老、抗肿瘤等作用，是天然的抗氧化剂，同时对微生物具有较强的抑制作用［17-19］。

此外茶多酚还可以降血糖［20-21］；降血脂、抗动脉粥样硬化；抗凝血、促纤溶、防止血栓形成；防止及减轻辐射损伤；并能抑制肠道致病菌，对双歧杆菌有促进作用，可改善人体肠道的微生态，增强肠道的免疫功能［22］。

本实验对红螺红茶、碧螺春绿茶、紫芽普洱茶（生茶）3 种茶叶水提物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌抑菌效果进行了研究，发现3 种茶叶对黑色素瘤细胞都有抑制作用，紫芽普洱茶（生茶）＞碧螺春绿茶＞红螺红茶；3 种茶叶对细菌供试菌有抑菌效果，紫芽普洱茶（生茶）的抑菌效果最佳，碧螺春绿茶、红螺红茶次之。本实验仅对水提方法得到的1种浓度进行了研究，具有一定的局限性，下一步将对不同提取方法得到的不同浓度提取物抗肿瘤、抑菌效果及最低抑菌浓度进行研究。