舌鳞状细胞癌细胞株CAL27外泌体源性miR-21、miR-221和miR-222的表达

李蕾 邹婷婷 王闻天

【摘 要】 目的：探讨分析舌鳞状细胞癌细胞株CAL27外泌体源性miR-21、miR-221和miR-222的表达水平。方法：培养舌鳞状细胞癌细胞株CAL27和正常口腔上皮粘膜角质细胞HOK进行试验研究，从培养细胞中提取外泌体，并采用实时荧光定量PCR检测外泌体miR-21、miR-221和miR-222的表达水平。结果：舌鳞状细胞癌细胞株CAL27外泌体源性miR-21、miR-221、miR-222表达水平显著高于正常口腔上皮粘膜角质细胞HOK（p<0.05）。结论：舌鳞状细胞癌细胞株CAL27外泌体源性miR-21、miR-221和miR-222异常表达，有可能参与口腔癌的增殖、迁移与侵袭。

【关键词】 舌鳞状细胞癌细胞株;外泌体;miR-21;miR-221;miR-222

【中图分类号】 R739.86   【文献标志码】A   【文章编号】1005-0019（2020）17-089-02  舌鳞状细胞癌为口腔颌面部较常见的一种恶性肿瘤，具有发生率高、复发率高、存活率低、预后差等特点，故早期诊治本病是患者预后改善的关键。近年，随着分子生物学检测技术的不断发展以及外泌体研究的不断深入，已有大量研究证实外泌体在人体多种疾病特别是癌症的发生、发展中有着重要的作用。目前已有研究证实外泌体源性miR-142-3p可以促进舌鳞状细胞癌发展与转移，致使患者预后不良[1]，但关于外泌体源性miR-21、miR-221、miR-222在舌鳞状细胞癌细胞株的表达情况及作用鲜有报道，为此，本研究选择舌鳞状细胞癌细胞株CAL27和正常口腔上皮粘膜角质细胞HOK进行试验研究，以探析舌鳞状细胞癌细胞株CAL27外泌体源性miR-21、miR-221和miR-222的表达水平。

1 方法

1.1 细胞培养 将CAL-27细胞放在含10%胎牛血清H-DMEM培养基，将HOK正常口腔上皮角质细胞放在HOK培养基中进行培养，培养环境设置为：湿度95%，温度37℃，二氧化碳体积分数5%，每隔2d更换1次培养液，并选择对数生长期细胞作下一步试验。

1.2 提取外泌体 将选中的细胞放置在细胞培養皿中进行培养，待其融合到80%时应用适量无菌PBS溶液对培养皿进行清洗，反复3次，加入培养液继续培养48h。然后收集10ml培养上清液离心处理15min已将大的细胞碎片去除，再离心处理20min将小的细胞碎片去除，离心处理30min去除大分子蛋白。此时收集上清液，根据4：1的比例添加沉降剂混匀，在4℃环境中静置12h。再次离心处理5min，弃去上清液后收集到黄白色沉淀物即为外泌体。用PBS溶液洗涤沉淀并重悬外泌体且离心处理70min，弃去上清液后再次用PBS溶液重悬，并在-80℃环境中保存待用。

1.3 镜下察看外泌体的形态 取10μL外泌体于铜网中进行沉淀过滤，吸取浮液;然后再在铜网上加入10μL2%磷戊酸过滤，吸取浮液。铜网在常温下干燥2min后将其放在透射电镜下察看外泌体的形态。

1.4 Western blot检测 在外泌体中分别加入1mlTrizol裂解液、10μl苯甲基酰磺酰氟、10μl的cocktail蛋白酶抑制剂以提取蛋白。取适量提取的蛋白溶液，加入4倍量的5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液混匀，进行SDS-PAGE电泳实验。电泳结束后将凝胶取出，放在滤纸上使其形成凝胶转印堆积层，进行western-blot转膜。加入适量CD63、CD81单克隆抗体稀释，在4℃环境中孵育24h，进行TBST洗膜，再加入适量二抗稀释液在室温下孵育1h，TBST洗膜。随后把杂交膜放置在透明塑料板，并加入适量化学荧光发光底物，静置5min后吸取杂交膜表面的底物液，并将杂交膜放到暗盒中让其显影。

1.5 实时荧光定量PCR检测 先根据TRNzol Universal总RNA提取试剂盒的说明书操作步骤进行miRNA提取，再依据All-in-One First Strand Synthesis Kit试剂盒说明书获得反转录产物cDNA，设置PCR循环反应条件：激活95℃ 120s;变性95℃ 15S，退火 60℃ 60S，40个循环进行Q-PCR反应。

1.6 统计学方法 用统计学SPSS23.0软件，计量资料经t检验，P<0.05为差异存在统计学意义。

2 结果

在透射镜下见CAL27癌细胞株、HOK正常细胞中均含有外泌体，直径范围在50～100nm，外形基本相似，均为椭圆形，且经Western blot检测见外泌体中含有CD81、CD63特异性抗体，进一步证实检测到外泌体。而且舌鳞状细胞癌细胞株CAL27外泌体源性miR-21、miR-221、miR-222表达水平显著高于正常口腔上皮粘膜角质细胞HOK（p<0.05），见图1。

3 讨论

现代医学已证实[2]，外泌体源性miRNA对肿瘤细胞的发生、发展以及耐药具有一定的调节作用，有望成为癌症治疗的新研究方向。相关文献报道[3]，在乳腺癌、肺癌细胞提取所得的外泌体中可发现miR-21、miR-221和miR-222表达异常升高。有研究也发现[4]，miR-21、miR-221、miR-222为口腔癌早期诊断的标志物之一，其能够提高癌细胞增殖、迁移、侵袭能力，阻止肿瘤凋亡。除此之外，miR-221、miR-222还可以下调基质金属蛋白酶-3的表达水平，使肿瘤细胞对阿霉素等化疗药物的敏感性降低，促进耐药。本研究结果也显示，舌鳞状细胞癌细胞株CAL27外泌体源性miR-21、miR-221、miR-222表达水平显著高于正常口腔上皮粘膜角质细胞HOK。由此可见，舌鳞状细胞癌细胞株CAL27外泌体源性miR-21、miR-221和miR-222异常表达，有可能参与口腔癌的增殖、迁移与侵袭，但其具体作用机制有待进一步研究。

参考文献

[1] 唐慧，伍海姗，杨怡，等.外泌体源性microRNA在疾病诊疗中的研究进展[J].中南大学学报2015，40（11）：1270-1275.

[2] 姜鹏玲，张思浩，徐织，等.Exosomal miRNAs在肿瘤治疗中的研究进展[J].临床普外科电子杂志，2019，7（2）：35-39.

[3] 熊武，孙安梦，皇毅，等.内皮祖细胞外泌体中与血管生成相关的miRNAs生物信息学分析[J].中国医师杂志，2019，21（4）：499-502.

[4] 周李杰，余东升.miR-221/222在肿瘤中的研究进展[J].中华口腔医学研究杂志，2016，10（5）：356-359.