靶向沉默膀胱癌T24细胞系VEGF对树突状细胞分化成熟及免疫功能的影响

匡颖

【摘 要】 目的：探讨靶向沉默膀胱癌T24细胞系VEGF对树体状细胞（DC）分化成熟、免疫功能的影响。方法：设置含VEGF干扰序列慢病毒载体LV-VEGFA-RNAi的实验组、不含有效感染VEGF的阴性对照组组及慢病毒载体命名LV-CON的空白对照组，分别对各组T24细胞进行感染，用流式细胞仪及显微镜对各组VEGF mRNA表达情况进行评价。结果：相较于空白及阴性对照组，实验组T24细胞中VEGF mRNA表达受明显的抑制，荧光强度明显。结论：靶向沉默膀胱癌T24细胞系VEGF表达可促进微环境DC成熟，提高免疫功能，修复DC被损伤的免疫功能及提高DC抗肿瘤能力。

【关键词】 靶向沉默;膀胱癌;T24细胞系;血管内皮生长因子;树突状细胞

【中图分类号】 R737.14   【文献标志码】A   【文章编号】1005-0019（2020）17-252-02  膀胱癌为泌尿科常见的恶性肿瘤疾病，研究表明免疫逃逸为引起疾病发病及进展的重要机制。树突状细胞（DC）为肿瘤发病中常见的细胞受体，同时也在抗肿瘤免疫机制中也有重要作用[1]。血管内皮生成因子（VEGF）为膀胱癌中活性强的血管生成因子，研究表明肿瘤微环境中，VEGF会引起肿瘤患者外周血细胞或肿瘤组织中DC前体细胞的成熟度降低，而成熟DC的减少则可引起肿瘤免疫逃逸，由此推测多可有效抑制VEGF分泌则可增加成熟DC的数量，发挥抗肿瘤的效果[2]。本次研究中，探讨借助RNAi技术构建VEGF病毒干扰载体，借助靶向沉默膀胱癌T24细胞系VEGF表达对促进DC成熟数量增加及调节机体免疫功能的价值，报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 人膀胱癌T24细胞系;人外周血单个核细胞;慢病毒干扰载体LV-VEGFA-RNAi、阴性对照载体LVCON;RNA提取试剂盒、PCR扩增物;人VEGF酶联免疫吸附测定试剂盒。

1.2 方法 （1）膀胱癌T24细胞感染。正式感染前依照比例计算病毒用量，人膀胱癌T24细胞根据实验组（含有针对VEGF有效干扰序列的慢病毒载体命名的LV-VEGFA-RNAi）、阴性对照组（不含有效感染的VEGF）及空白对照组（慢性病毒载体命名为LV-CON）设置接种在12个孔板上，每孔均含0.5×105个细胞，每组设3个复孔，培养基选择体积分数为10%的胎牛血清、1%双抗RPMI-1640培养基，将培养基置于温度37℃及5%二氧化碳的孵箱中，3天后将培养基取出依照滴定测定的结果对各组T24细胞做慢病毒感染，12h更换培养基，在荧光显微镜下观察病毒的感染效率，待各组细胞增殖感染后4d提取RNA，测定各组VEGF mRNA表达水平。（2）T24细胞上清、DC培养。应用100ng/ml含rh的GM-CSF、100ng/ml含rh 的IL-4，接种在1640培养基上，对应前面的T24细胞分组，置于孵箱中培养到第4d、6d，在培养基上加入90%汇合度的培养上清，培养至14d是收集成熟DC，分别用鼠抗人CD1a、CD83、CD86单克隆抗体进行染色及流式细胞分析。

1.3 统计学方法 采用SPSS20.0软件做统计学结果分析，计量资料用t检验，以P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 慢病毒感染T24细胞 实验组在营养强度上显著高于阴性与空白对照组，但是阴性及空白对照组在荧光强度上组间无显著差异。在VEGF mRNA表达上，实验组表达水平明显较对照组更低，而对照组间无显著差异，详见表1。

2.2 T24细胞上清及DC共培养结果 T24上清同未成熟DC共培养第14d，显微镜下显示实验组DC变大或变圆，出现明显毛刺，属成熟的DC特征;阴性与空白对照DC的多呈半贴壁情况，毛刺不显著，成熟度均较实验组更低。

3 讨论

DC为肿瘤环境中功能强大的细胞，可激活T淋巴细胞对特异性抗原的免疫应答能力。DC分为成熟与未成熟两种形态，成熟形态的DC小且圆，镜下呈葡萄样集簇，表面光滑[3]。对膀胱癌这一恶性肿瘤疾病，DC成熟明显受抑制，成熟DC具有显著的呈递抗原能力及活化T细胞能力，然而VEGF则会将DC抑制在未成熟的状态，让DC只具备加工以及处理抗原的能力，无法发挥呈递抗原以及活化T细胞的能力，这使得DC抗肿瘤效应无法正常发挥。

绝大多数的癌症病患有分泌VEGF的能力，且肿瘤组织、血清中均可检出VEGF异常增高情况，膀胱癌虽然为下段癌症也同样存在VEGF明显增高的情况。肿瘤患者中，机体分泌的VEGF大量分泌可诱导DC的分化及成熟，引起DC凋亡，这样会阻止DC抗原呈递，引起肿瘤免疫逃逸。在本次实验中，设计病毒干扰T24细胞，研究中进行了分组，结果显示同空白及阴性对照组组别比较，实验组在VEGF mRNA表达上明显更低，且DC表现多为圆形及毛刺样，这证实T24细胞分泌VEGF会抑制微环境中DC分化及成熟。

综上所述，对膀胱癌这一恶性肿瘤疾病，对VEGF作用DC途径的干扰，可明显增加肿瘤微环境中的DC成熟度，让DC免疫功能修复提高，并提高DC疫苗疗效，這为膀胱癌的临床治疗提供有利参考。

参考文献

[1] 陈烁， 龚银银， 颜景颖， 等. CXCR4基因沉默对膀胱癌T24细胞增殖和凋亡及迁移能力的影响[J]. 福建医科大学学报， 2019，15（3）：102.

[2] 王俊霖， 杨勇， 陈从波， 等. 丝氨酸蛋白酶抑制剂B3基因沉默对膀胱癌T24细胞上皮-间充质转化及侵袭迁移的影响[J]. 中华实验外科杂志， 2018， 35（6）：1166-1166.

[3] 庞昆， 李美丽， 陈波，等. ERH基因对人膀胱癌T24和5637细胞迁移、侵袭的影响[J]. 中国医师杂志， 2019， 21（6）：856-861.