芍倍注射液对痔急性发作模型大鼠直肠肛管组织病理形态学、炎症反应的影响研究

黄丹丹，刘智敏，赵严冬，呙耀宇，任东林△

1中山大学附属第六医院肛肠外科 广东广州510655

2中山大学附属第六医院病理科 广东广州510655

痔病是常见的肛肠科疾病，我国成年人痔病患病率接近50%，且随着年龄增长呈递增趋势，严重影响人们的健康与生活[1]。痔病发病机制尚未明确，痔组织病理主要表现为血管结构异常、间质胶原代谢改变、炎性细胞浸润、细胞炎症因子高表达等[2-3]。炎症因子对痔血管造成氧化损伤，而损伤血管又可进一步促进炎症因子释放，进而引起出血等症状[4]。芍倍注射液采用中药提纯有效成分入药，主要由柠檬酸、没食子酸、芍药苷三种单体组成，其中，柠檬酸和没食子酸具有酸涩收敛止血的作用，芍药苷具有抗炎、抗纤维增生作用，其在临床应用中获得较好疗效[5-6]。本研究通过建立痔急性发作大鼠模型，探讨芍倍注射液对痔急性发作期直肠肛管病理组织形态、炎症反应的影响，为临床应用提供实验依据，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

75只健康清洁级6周龄雄性SD大鼠，体质量（250±20）g，购自广州中医药大学实验动物中心，许可证号：SCXK（粤）2013-0034。

1.2 药品和试剂

芍倍注射液（河南泰丰生物科技有限公司，国药准字Z20030126），巴豆油（北京偶合科技有限公司）；乙醚（广州化学试剂厂）；吡啶（上海纪宁实业有限公司）；水合氯醛（国药集团化学试剂有限公司）；伊文思蓝（evans blue，EB）、甲酰胺（sigma公司）；苏木素—伊红染色液（武汉赛维尔生物科技有限公司）；白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-1（IL-1）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和ELISA试剂盒（上海酶联生物科技有限公司）。

1.3 实验仪器

酶标仪（赛默飞世尔）；涡旋混匀器（其林贝尔仪器制造有限公司）；正置显微镜、成像系统（广州市明美光电技术有限公司）；脱水机、石蜡包埋机（武汉俊杰电子有限公司）。

1.4 实验方案

1.4.1 分组 将75只大鼠随机平均分为3组：对照组、模型组和治疗组，每组各25只。对照组不做处理，模型组和治疗组均进行造模及治疗。

1.4.2 造模 制备痔急性发作大鼠模型：将蒸馏水、吡啶、乙醚和6%巴豆油按1:4:5:10的比例混合，组成巴豆油混合液，将浸吸0.16 mL巴豆油混合液的棉球置入大鼠肛门内，10 s后拔出，6 h后可见大鼠肛周组织充血肿胀并有炎性渗出，即建模成功。

1.4.3 药物配制 取芍倍注射液原液与生理盐水按1:2的比例稀释，配制芍倍注射液稀释液。

1.4.4 给药治疗 造模6 h后开始给药治疗：（1）模型组：距肛门0.5 cm处于黏膜下12点、4点、8点位注射生理盐水，每个点注射50 μL，总共150 μL。（2）治疗组：距肛门0.5 cm处于黏膜下12点、4点、8点位注射芍倍注射液稀释液，每个点注射50 μL，总共150 μL。

1.5 标本采集与观察指标

1.5.1 病理学观察 分别于给药后第1天、第3天、第7天每组随机处死5只大鼠，以棉签置入肛门内指引，沿肛周0.5 cm处环形分离肛门，深至直肠上15 mm处，剪断肠管移出标本，固定于10%甲醛液中，脱水，石蜡包埋，切片，HE染色，均于20倍和100倍显微镜下放大获取图片拍照并做进一步的组织病理学观察分析各组大鼠直肠肛管病理组织形态变化情况。直肠肛管组织病变评分标准如下[7]：以炎症细胞浸润、充血/出血、血管扩张、上皮细胞坏死/损伤为观察指标，进行半定量评分。病损组织比例0%，0分；病损组织比例＜10%，1分；病损组织比例11%～25%，2分；病损组织比例26%～75%，3分；病损组织比例＞75%，4分。由两位病理科医师独立评分。

1.5.2 直肠肛管系数、直肠肛管湿干重差和炎症因子测定 给药后第7天每组各随机挑取5只大鼠，眼眶取血，离心，分离血清，ELISA测定大鼠血清细胞因子IL-6、IL-1、TNF-α含量；并切取从肛门皮毛边缘算起长度为15 mm的直肠肛管并称湿重，并置于80℃干热16 h后称取干重。直肠肛管系数=直肠肛管质量（mg）/大鼠体重（g）；直肠肛管湿干重差=湿重-干重。

1.5.3 直肠毛细血管通透性测定 给药后第6天每组挑取5只大鼠，予尾静脉注射30 mg/kg伊文思蓝，24 h后处死大鼠，取直肠肛管组织20 mm，置于1 mL甲酰胺溶液中，60℃恒温浸泡24h，1000g离心10min后取上清，测定OD620值。用伊文思蓝标准定量做标准曲线，同时读取OD值，将测得样品OD值计算样品中伊文思蓝含量。

1.6 统计学方法

选用SPSS 22.0统计学软件对数据进行处理。计量资料以（±s）或M（QL，QU）表示，符合正态分布的计量资料组间比较采用单因素方差分析（Oneway ANOVA），两两组间比较采用Bonferroni检验；符合偏态分布的计量资料组间比较采用非参数秩和检验（Wilcoxon test）。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠直肠肛管组织病理形态学观察结果

2.1.1 各组直肠肛管组织病理形态学变化情况（1）对照组：大鼠在不同时间点的直肠肛管组织黏膜形态正常，黏膜层腺体排列整齐，未见炎症细胞浸润。（2）模型组：与对照组相比，给药后第1天，直肠肛管组织黏膜表面糜烂，上皮坏死、脱落，并可见大量炎性渗出物质，黏膜下层充血出血，血管扩张明显，伴大量急性炎症细胞浸润，可见明显急性血管炎改变，间质高度水肿，较多炎性肉芽组织形成；给药后第3天，组织病变情况基本同第1天；给药后第7天，间质水肿较第1天、第3天减轻。（3）治疗组：给药后第1天，直肠肛管组织黏膜层上皮局部糜烂，可见再生修复现象，黏膜下层充血、血管扩张，间质水肿较模型组改善，伴少量急、慢性炎性细胞浸润，间质内见较多纤维母细胞，炎性肉芽组织底部出现机化现象，可见较多新生薄壁血管；给药后第3天，组织病变较第1天轻微改善；给药后第7天，直肠肛管组织黏膜上皮大部分再生修复，间质水肿明显减轻，炎症细胞进一步减少，间质纤维组织显著增生，可见大量新生薄壁血管。见图1。

2.1.2 模型组与治疗组大鼠肛周组织直肠肛管病变评分比较 治疗组给药后各时点的炎症细胞浸润评分、充血/出血评分均低于模型组，差异有统计学意义（均P＜0.05）。给药后第1天，两组血管扩张评分、上皮细胞坏死/损伤评分比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）；给药后第3天、第7天，治疗组的血管扩张评分、上皮细胞坏死/损伤评分均低于模型组，差异有统计学意义（均P＜0.05）。见表1。

图1 各组大鼠直肠肛管组织病理形态学动态变化（HE染色，×20，×100）

表1 模型组与治疗组大鼠肛周组织直肠肛管病变评分比较 分，M（QL，QU）

2.2 各组大鼠直肠肛管系数、直肠肛管湿干重差比较

模型组直肠肛管系数、直肠肛管湿干重差较对照组大（P＜0.0001），表明造模成功。治疗组直肠肛管系数、直肠肛管湿干重差较模型组小（均P＜0.05），表明经芍倍注射液稀释液注射治疗后，大鼠直肠肛管炎症水肿显著减轻。见图2。

图2 各组大鼠直肠肛管系数及直肠肛管湿干重差情况比较（# P＜ 0.0001与对照组比较；** P＜ 0.01，* P＜ 0.05与模型组比较）

2.3 各组大鼠细胞炎症因子水平比较

与对照组相比，模型组大鼠血清中的TNF-α、IL-1、IL-6水平均增高（均P＜0.0001）。与模型组相比，治疗组大鼠血清中的TNF-α、IL-1、IL-6水平均下降（均P＜0.05）。见图3。

图3 各组大鼠细胞炎症因子表达情况（# P＜ 0.0001与对照组比较，* P＜ 0.05与模型组比较）

2.4 各组大鼠直肠毛细血管通透性比较

与对照组相比，模型组大鼠直肠肛管的伊文思蓝含量增高（P＜0.0001）。与模型组相比，治疗组直肠肛管的伊文思蓝含量下降（P＜0.01）。见图4。

图4 各组大鼠伊文思蓝含量比较（# P＜ 0.0001与对照组比较，* P＜ 0.01与模型组比较）

3 讨论

痔病是临床上常见的肛肠疾病之一，其病理常常表现为肛垫病理性肥大、移位，局部血管循环障碍、组织炎症反应，和（或）黏膜组织坏死等特征[8]。痔病是人类特有疾病，痔病动物模型以模拟其病理学特征为目的[9-10]。目前，相关文献介绍的痔动物模型造模方法主要有以下几种：（1）肛门周围皮肤创伤模型；（2）家兔肛门细菌性溃疡模型；（3）大鼠食管静脉曲张模型；（4）醋酸致肛门溃疡模型；（5）大鼠巴豆油肛门肿胀模型[7,11-12]。其中最常用也较为成熟的仍是化学试剂局部刺激方法。本研究采用大鼠巴豆油肛门肿胀模型，观察造模后第1天、第3天、第7天时直肠肛管病理组织形态造模后大鼠可见直肠肛管黏膜表面糜烂，上皮坏死、脱落，间质高度水肿、炎症细胞浸润，血管扩张并炎性改变，符合痔急性发作的病理形态。

芍倍注射液在临床使用多年，实践证明其对出血性痔治疗效果显著，但其对痔组织病理学影响仍尚未明确。临床上，我们无法取得痔注射治疗前后痔组织进行病理学观察。因此我们通过构建痔急性发作大鼠模型，模拟人痔注射治疗操作，将芍倍注射液在大鼠肛管黏膜下进行注射治疗，并动态观察治疗后直肠肛管病理组织形态改变。本研究采用炎症细胞浸润、充血/出血、血管扩张、上皮脱落/坏死四个指标进行半定量评价，结果显示芍倍注射治疗在急性炎症期即能减少炎症细胞浸润，改善血管炎症。给药后第3天，芍倍注射治疗组直肠肛管黏膜上皮开始修复。这说明芍倍注射液能改善局部组织炎症反应，同时促进黏膜上皮层修复再生。

痔病临床多表现为肿胀、便血、疼痛等症状，这跟组织炎症水肿、血管损伤密切相关。直肠肛管系数、直肠肛管湿干重差、直肠毛血管通透性等是评价局部组织炎症水肿重要指标。细胞炎症因子TNF-α、IL-1、IL-6等在急性炎症中起到重要作用[13]。TNF-α是致炎作用最强、产生最快的炎症介质，具有促进炎症细胞聚集活化及释放炎症介质的作用[14]。IL-1、IL-6等多种炎症因子能诱发局部组织损伤[15]。本研究结果显示治疗组的直肠肛管系数、直肠肛管湿干重差、直肠毛细血管通透性均较模型组下降，血清中TNF-α、IL-1、IL-6水平低于模型组。这提示芍倍注射液可通过抑制炎症细胞释放炎症因子，有效减轻局部组织炎症水肿。

芍倍注射液中含有重要成分“芍药苷”，既往文献报道芍药苷能降低LPS诱导的髓核细胞中TNF-α、IL-1、IL-6水平，发现芍药苷抑制核转录因子NF-κB向核内转运，具有抗TNF-α诱导的趋化因子产生和白细胞迁移的抗炎能力，其机制与抑制NF-κB和ERK通路有关[16-18]。本研究结果显示芍倍注射液具有抗炎作用，我们推测可能芍药苷发挥了重要作用，其具体作用机制仍待进一步研究。

综上所述，芍倍注射液能有效改善痔急性发作模型大鼠直肠肛管病理组织形态，抑制局部炎症反应、促进直肠肛管黏膜修复。但其具体分子机制尚未明确，仍有待进一步研究。