基于“热证可灸”研究麦粒灸对胃热证大鼠胃黏膜屏障的影响*

谢宇锋，余云进，杨锦兰，陈 赟，冯 军△，杨宗保

(1.广州中医药大学深圳医院，广东 深圳 518034； 2.广州中医药大学，广东 广州 510006；3.厦门大学医学院，福建 厦门 361005)

胃热证主要表现为胃火炽盛、胃脘灼痛等实热症状，是热证中的典型病证。动物实验研究表明，胃热证大鼠的胃黏膜组织出现损伤、炎性病变等病理学改变[1-2]，故胃热证与胃黏膜损伤的相关病变具有一致性。灸法作为中医的特色疗法，具有适应症广泛、便于使用的特点。大量实验结果表明，灸法对胃黏膜损伤具有保护和修复作用[3-4]。古往今来，虽然灸法用于治疗热证的理论探讨和实践诸多，但因其相关的实验开展较少，具体的作用机制尚未揭示。

胃黏膜屏障对胃黏膜损伤具有防御作用，其防御机制由黏液-碳酸氢盐屏障、黏膜屏障等相互协调而成[5]。三叶因子2(Trefoil Factor Family 2，TFF2)是胃黏膜的重要保护因子，一定程度上反应了胃黏膜屏障的防御功能。据此，本研究拟通过研究麦粒灸对胃热证胃黏膜损伤大鼠胃黏膜屏障的影响，以阐释麦粒灸对胃黏膜保护作用的机制及“热证可灸”理论的可行性。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级雄性SD大鼠24只，体质量(150±20)g，购买自上海斯莱克动物实验有限责任公司[许可证号：SCXK(沪)2017-0005]，饲养于厦门大学实验动物中心，适应环境7 d后开始实验，室温控制在20～22℃，相对湿度65%～70%,自然光明暗周期，自由饮食。

1.2 主要仪器与试剂

1.2.1 仪器 匀浆机(德国IKA公司,型号：IKA T10 basic)；高速低温离心机(SCILOGBX，型号D3024R)；低速离心机(SCILOGBX，型号：S1010E);基因扩增仪(苏州东胜兴业科学仪器有限公司，型号：ETC811)；超微量分光光度计(NannoVue，型号：NanoVue Plus)；荧光定量PCR仪(天隆科技,型号：Gentier96E)；GloMax酶标仪(Promega，型号：GM3030)；病理切片机(Leica,型号:CM1850)；智能生物显微镜(奥林巴斯Olympus公司，型号:BX53)。

1.2.2 试剂 辣椒粉(泰州春和源食品有限公司，许可证号：SC10332128102093)；无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司，批号：20190213)；TFF2 ELISA试剂盒(Elabscience科技生物公司，货号：R1873)；RNA提取试剂盒(艾德莱生物技术有限公司，货号：RN03)；逆转录试剂盒(TOYOBO，货号：FSQ-101)；无毒性核酸染色剂[生物工程(上海)股份有限公司，货号：EA26BA0029]。

1.3 造模与分组

适应性喂养后，将大鼠随机分为正常组、模型组、麦粒灸组。胃热证胃黏膜损伤模型制备：参照ZOU Z J等[6]方法进行造模。将80 g辣椒干粉混入1 L的纯水中，经120目筛过滤后制成辣椒混悬液(80 mg/mL)。模型组大鼠、麦粒灸组大鼠灌胃辣椒混悬液(10 mL/kg)，每天经口灌胃2次，连续6 d，第6天灌胃结束后，大鼠禁食不禁水12 h，于第7天灌胃无水乙醇(1 mL)1次。结束后3 h大鼠恢复自由饮食。

1.4 干预方法

1.4.1 选穴方法 根据课题组前期研究艾灸干预胃热证胃黏膜损伤机制，麦粒灸组治疗选用足阳明胃经梁门、足三里为治疗穴位[7]，参照李忠仁《实验针灸学》[8]对大鼠的穴位定位。大鼠梁门穴位于腹部正中线与乳头之间连线的中点，脐上约20 mm；大鼠足三里穴位于膝关节后外侧，腓骨小头下约5 mm处。将所选穴位穴区使用脱毛膏脱毛、并用湿棉签将鼠毛擦拭干净，随后对穴区使用苦味酸进行标记。

1.4.2 艾灸方法 造模结束后第2天开始治疗。将所有麦粒灸组大鼠仰卧朝上用鼠板固定，用镊子放置麦粒于穴位上(将1 mg纯艾绒捏制为基底部2.5～3.0 mm、高度4～5 mm的麦粒)，线香点燃，每个穴位共灸7个麦粒，每个麦粒的燃烧时间为10～12 s，期间用红外线测温仪监测施灸部温度，温度控制45～48℃。麦粒灸1次/d,共7 d。正常组和模型组大鼠同样捆绑固定，不做麦粒灸治疗。

1.5 样本采集

所有组别大鼠于第7天麦粒灸治疗结束后禁食不禁水，12 h后，经腹腔注射10%水合氯醛(3 mL/kg)麻醉大鼠，用手术器械剖开大鼠腹部，充分暴露腹主动脉并取血5 mL,血浆于常温静置1 h后,离心5 min(转速3 000 r/min),离心后用取使用移液枪将血清吸取,移置于冻存管，并放入-80℃冰箱保存，备用于ELISA检测。用手术剪将大鼠全胃取出分离，沿胃大弯剪开，在生理盐水中洗净，随后充分展开胃黏膜，观察胃黏膜情况，将胃黏膜组织分成2份，一份放入10%多聚甲醛中固定24～48 h，包埋、切片、染色。另一份胃黏膜组织迅速置入液氮冷冻保存，1 h后移入-80℃冰箱，用于QT-PCR检测。

1.6 观察指标

1.6.1 大鼠一般行为学观察 ①外观：唇、舌、趾、爪、耳、毛发颜色;②精神活动状态：精神状态正常，喜静，喜动，兴奋，叫声嘶哑或响亮;③大小便情况：小便色黄或色清，大便正常、秘结或稀溏。

1.6.2 胃黏膜组织病理学光镜 胃黏膜组织在固定结束后进行梯度酒精脱水、包埋、二甲苯透明、切片。随后采用HE染色，在400倍光镜下观察胃黏膜组织病理形态并采集图片。

1.6.3 实时荧光定量(QT-PCR)检测胃黏膜组织TFF2、肿瘤坏死因子(TNF-α) 称取约100 mg组织样品，加液氮研磨，用1 mL trizol室温裂解5 min，4℃ 12 000 rpm离心10 min；取上清，按常规方法提取总RNA，随后进行RNA浓度测定，取1 μL进行逆转录，总体系10 μL，制备cDNA模板。按照说明书进行TFF2 mRNA、TNF-α mRNA的RT-PCR检测，以β肌动蛋白(β-actin)为内参基因，引物序列见表1，用两步法进行PCR扩增，测定TFF2 mRNA、TNF-α mRNA表达Ct值，将获得目的基因Ct值减去内参基因Ct值，得到△Ct值后，采用2-△△Ct方法[9]分析mRNA相对表达量。

表1 RT-PCR检测引物信息表

1.6.4 血清TFF2含量检测 ELISA测定血清TFF2含量。具体操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 各组大鼠一般行为学比较

正常组大鼠毛发光亮，外观颜色正常，精神状态好，大小便情况无异常;模型组大鼠的毛发发黄，唇、舌、趾、爪、耳颜色偏红，喜动，暴躁，叫声嘶哑，小便色黄，大便干结量少;麦粒灸组大鼠较模型组大鼠好转，外观颜色有所改善，大小便情况较正常。

2.2 各组大鼠胃黏膜组织病理形态学比较

正常组胃黏膜皱襞完整、结构清晰、层次分明，未见损伤或脱落;模型组胃黏膜出现皱襞萎缩、上皮细胞脱落坏死，细胞间隙增宽，炎症细胞浸润;麦粒灸组胃黏膜皱襞破损有所恢复，细胞结构及固有腺体基本正常，炎症浸润减轻。见图1。

注：A、B、C分别为正常组、模型组、麦粒灸组。图1 大鼠胃黏膜组织病理学结果(400×)

2.3 各组大鼠胃黏膜组织TFF2 mRNA、TNF-α mRNA表达比较

相比正常组，模型组大鼠胃黏膜组织中的TFF2 mRNA含量表达降低(P<0.01)、TNF-α mRNA表达升高(P<0.01),差异均具有统计学意义；在麦粒灸组中TFF2 mRNA、TNF-α mRNA表达较模型组接近正常组(P<0.01或P<0.05)，结果显示干预后含量得到有效逆转，差异具有统计学意义。见表2、图2。

表2 各组大鼠胃黏膜组织TFF2 mRNA和TNF-α mRNA的相对表达量

注：a为TFF2 mRNA,b为TNF-α mRNA。图2 各组大鼠胃黏膜组织TFF2 mRNA、TNF-α mRNA表达量(n=8)

2.4 各组大鼠血清TFF2含量比较

相比正常组，模型组大鼠的血清TFF2含量表达降低，差异具有显著统计学意义(P<0.01)；在麦粒灸组中的表达较模型组接近正常组，与模型组相比，麦粒灸组表达量差异具有显著统计学意义(P<0.01)。见表3。

表3 各组大鼠血清TFF2含量变化

3 讨论

灸法治疗热证属于反佐治法，早在《黄帝内经》中便提出：“寒热虚实，火当自之”，《素问·六元正纪大论》云：“火郁发之”，均为“热证可灸”奠定了理论基础。历代不少医家对“热证可灸”均付诸于实践，如金元四大家之一的朱丹溪在针灸临床中运用“灸治实热证”和“灸治虚热证”[10]，《千金翼方》则记载：“胃中热，灸三里三十壮。”使“热证可灸”得到佐证和发展。至现代研究则揭示，艾灸能从抗感染、体液代谢、中枢神经递质水平和免疫功能等调节作用于热证[11]。麦粒灸是灸法的分支之一，是用麦粒状大的艾柱直接灸的一种方法，具有灸量大、疗效显著的特点，相比传统艾灸，麦粒灸温热引起的灼痛感减小、瘢痕形成相对少、适应病症广泛、易于被患者所接受。在主治功能上，麦粒灸具有既能祛寒又可泄热的双向性特点[12]。本课题组早期的研究也表明，艾灸足阳明胃经穴“梁门”“足三里”对胃热证大鼠胃黏膜损伤的修复有促进作用[7]，但灸法治疗热证的作用机制仍有待进一步深入研究，所以本研究以胃黏膜屏障为切入点，研究麦粒灸胃经穴促进胃热证大鼠胃黏膜损伤修复的作用机制。

胃黏膜屏障主要包括胃黏液屏障和胃黏膜上皮屏障。而胃黏液屏障在胃黏膜屏障中起着核心的作用，既可以使胃黏膜上皮对胃内容物产生机械损伤和防御作用，又可以抑制胃酸和胃蛋白酶，使胃黏膜上皮的被侵蚀减少。胃黏液屏障主要包括黏蛋白、水、电解质、三叶肽(Trefoil factor family,TFFs)以及脂类，覆盖于胃黏膜上皮细胞表面[13]。TFFs是胃黏液屏障的主要组成成分之一，包含了乳癌相关肽(pS2或TFF1)、解痉多肽(SP或TFF2)和肠三叶因子(ITF或TFF3)[14]。作为黏液层的一个主要组成成分，TFFs可以将胃黏液层中的另一个重要组成成分黏蛋白连接起来，使单独的黏蛋白形成相互重叠、相互穿插的网状结构，从而使黏液凝胶层的结构更稳定，从而对胃黏膜产生保护作用[15]。Thim L等[16]研究发现，当TFFs含量下降，会导致胃黏膜的黏蛋白结合形成的多聚体下降，胃黏液凝胶结构变得松散、黏液层萎陷。因此，TFFs的含量可以作为反映胃黏液屏障功能的重要指标。TFF2是三叶因子家族中的重要成员，主要分布在胃窦和十二指肠等消化性溃疡易发部位。有研究表明，非甾体药物诱导的溃疡在TFF2基因敲除的小鼠中更为敏感[17]。相关研究表明，给予外源性的TFFs可以减轻NSAIDs、乙醇以及应激导致的胃黏膜损伤，也可以促进伤口愈合的速度[18-19]，在体内出现损伤时，TFF2能通过细胞迁移以保护胃黏膜受损[20]。因此，TFFs不仅可以反映胃黏膜屏障的功能，而且是重要的胃黏膜保护因子。

实验结果显示，胃热证证候下大鼠毛发发黄，唇、舌、趾、爪、耳颜色偏红以及喜动、暴躁、叫声嘶哑、小便色黄、大便干结量少，处于机能亢进状态。胃火炽盛则耗伤津液，大鼠出现口渴多饮、叫声嘶哑、小便色黄和大便秘结；胃火上炎，血得热则行，毛细血管充血，可见大鼠唇、舌、趾、爪和耳颜色偏红。因此胃热证候下大鼠出现多种热证反应。而经麦粒灸干预后，大鼠毛发发黄，唇、舌、趾、爪、耳颜色偏红以及喜动、暴躁、叫声嘶哑、小便色黄和大便干结量少等胃热表现的证候特征均得到缓解。研究结果证明胃热证大鼠出现胃黏膜损伤[2]，本实验中组织病理学也进一步验证此观点，经麦粒灸干预后胃黏膜各层结构趋向完整，炎症细胞减少，未见明显出血点或出血灶形成，在组织病理学层面验证麦粒灸对胃热证大鼠胃黏膜损伤具有修复作用。但作用机理并不可知。因此针对胃黏膜组织屏障保护功能，借助QT-PCR技术，对胃黏膜组织中的TFF2、TNF-α进行检测。实验结果显示与正常组比较，胃热证大鼠胃黏膜中TFF2 mRNA表达量和血清中TFF2含量显著下降，胃黏膜中TNF-α mRNA的表达量显著上调，而艾灸胃经穴则可以上调胃热证大鼠胃黏膜中TFF2 mRNA的表达量和血清中TFF2含量，下调胃热证大鼠胃黏膜中TNF-α mRNA的表达量。说明艾灸胃经穴促进胃热证大鼠胃黏膜损伤修复的作用可能与上调胃热证大鼠胃黏膜中TFF2的水平相关。综上所述，本实验经一般行为学观察、组织病理学以及胃黏膜屏障保护因子检测，认为胃热证证候下胃黏膜屏障会受到破坏，炎症细胞浸润，麦粒灸可调节大鼠胃热证不适症状，改善胃黏膜破损，提高胃黏膜屏障保护因子水平，从而促进胃热证大鼠胃黏膜损伤修复，热证可灸具有可行性。