MicroRNA 与骨骼肌发育研究进展

王 潇，俄广鑫，娜日苏，宋美华，黄勇富*

（1.西南大学动物科技学院，重庆市牧草与草食家畜重点实验室，重庆市草食动物资源保护与利用工程技术研究中心，重庆 400715；2.山东省栖霞市庄园街道畜牧兽医工作站，山东栖霞 265300）

MicroRNA（miRNA）是一类进化保守的非编码RNA，主要通过与目标基因的3'UTR 序列结合，从而抑制目标基因的翻译或降解目标基因。近年来，大量研究表明miRNA 广泛参与骨骼肌的生长发育调控，如miR-1/206 家族、miR-133、miR-208 和miR-488 等被鉴定为肌肉特异性miRNA，在肌肉组织中特异表达或高表达，调控生物体的成肌过程，参与骨骼肌的生长发育[1-2]。作为维持机体功能必不可少的组织，骨骼肌与家养动物的产肉量等重要经济性状密切相关。因此，研究肌肉生长发育调控机制，通过分子育种提高畜禽个体产肉量是当前研究的热点之一。本文综述了miRNA 的产生及miRNA 在骨骼肌中的作用，以期为更好地研究miRNA 的功能和进一步解析肌肉生长发育的调控机制提供参考。

1 miRNA 产生与作用机制

miRNA 是一类进化保守长度约为 22 nt 的非编码小分子 RNA。Lee 等[3]通过染色体迁移技术在秀丽隐杆线虫（C.elegans）中克隆获得首例 miRNA lin-4。Reinhart 等[4]研究发现了第2 个 miRNA let-7，之后越来越多的miRNAs 相继在不同物种中被发现。miRNA通常以单拷贝、多拷贝或者基因簇等多种形式存在于基因组中，且在基因组中有固定的基因座位[5]。许多已知的miRNA 通常位于内含子内，但某些情况下也位于外显子。另外，还有部分miRNA 可以从长链非编码转录本中产生。如图1 所示，miRNA 首先起源于RNA 聚合酶II，一起被RNA 聚合酶II 从基因间、内含子或多顺反子位点进行转录合成具有特征性发夹茎环结构的初级miRNA （pri-miRNA），之后通过核酸内切酶（Drosha）和辅助因子（DGCR8）剪切形成70 nt 的前体miRNA（pre-miRNAs）[6-7]，pre-miRNA 再通过Exportin-5 将其从细胞核输出到细胞质[8]，随后被Dicer/TRBP 剪切形成不完全配对的成熟的miRNA 双链[9-10]。接着双链被解开，其中一条链被降解，另一条链保留形成成熟miRNA。然后miRNA 被整合到Argonaute（Ago）蛋白中形成RNA 诱导的沉默复合物（RISC），指导RISC 靶向mRNA，导致翻译抑制或mRNA 失稳及降解[11]。在动物中，miRNA 是否对靶基因mRNA 产生作用主要取决于靶mRNA 上是否存在与miRNA 种子序列（miRNA 5'端2～8 个碱基）互补配对的碱基序列[12]。miRNA 不仅可以与目标基因的3'端非编码序列结合，一些miRNA也能与靶基因 5' 端非编码序列区域或者编码区域结合发挥作用，有的miRNA 甚至可以直接与靶基因的启动子区域结合进而调控基因的表达[13]。miRNA 的功能一般都是负调控，但近期研究表明，miRNA 同样也可以促进基因的表达[14-15]，这进一步拓宽了人们对miRNA调控方式的认知。

2 肌肉发育相关miRNA 的检测方法

2.1 qRT-PCR 定量检测法 由于miRNA 分子片段小，通常对其反转录引物进行特异性设计，通过碱基互补配对原则进行扩增，使得利用qRT-PCR 定量检测miRNA成为可能，并且可以高度灵敏地检测出低表达的miRNA。如Wang 等[16]利用胎儿期和6 月龄山羊肌肉进行表达谱的研究，鉴定了464 种已知的miRNA 和83种新的miRNA，该研究首次提供了山羊肌肉中miRNA网络图，为阐明miRNA 和mRNA 之间复杂的调节网络以及肌肉发育的研究奠定了基础；基于对通路和网络的分析发现，miR-424-5p 和miR-29a 可能对肌肉发育具有重要的调节作用，为后续miRNAs 的功能和潜在靶点的研究提供了思路。实时荧光定量（qRT-PCR）可以很精确地定量分析miRNA 的表达，也经常用于验证预测的miRNA，是比较方便又有效的一种检测手段。

图1 miRNA 产生与作用机制[5]

2.2 高通量测序法 随着测序技术的发展，高通量测序成了研究miRNA 的重要手段，该技术可以在无需任何miRNA 序列信息的前提下研究miRNA 的表达谱，并发现和鉴定新miRNA 分子。因此，Ling 等[17]在波尔山羊上使用Solexa 深度测序技术鉴定了562 种保守的和5 种山羊基因组特异性miRNA，最后随机选择8 个miRNA进行验证，结果表明随机选择的8 个miRNA 的表达模式与Solexa 测序结果一致。这些数据促进miRNA 在山羊生长和发育过程中发挥的调节作用的研究进展。2014 年四川农业大学山羊研究团队以妊娠第45、60、105 天以及出生后第3 天的简州大耳山羊背长肌为材料进行深度测序，在这4 个阶段共鉴定出410 个已知的山羊miRNA、752 个miRNA 同源体和88 个新miRNA，对样品中的miRNA 读数进行计数，除3 个myomiRs 外，chi-miR-424、chi-miR-542-3p 和chi-miR-136-5p 等17个miRNA 的丰度平均超过10 000 个reads/每百万读数（RPM）[18-19]，表明这些miRNAs 在山羊骨骼肌发生过程中发挥重要作用。

截止目前，国内外已建立的miRNA 研究技术还包括微阵列芯片技术和Northern 印迹分析等，但由于这两种方法存在突出的不足，逐渐被qRT-PCR 定量检测法和高通量测序法取代。

3 miRNA 在肌肉发育网络中靶基因的预测与鉴定

在肌肉发育网络中，准确把握miRNAs 与靶标之间的关系一直是科学家们关注的焦点。众所周知，现阶段鉴定出的miRNA 数量很多，但大多miRNA 的功能并没有得到有效挖掘。因此，miRNA 靶基因的预测与鉴定成为miRNA 功能及机制研究的关键。靶基因的筛选有2 种方法：①利用网络在线软件（如TargetScan、PicTar、miRanda、miRecords、TarBase 等数据库软件）进行靶基因预测；②利用转录组测序筛选靶基因。靶基因预测或筛选之后，通过qRT-PCR 及Western Blot只能确定miRNA 与靶基因的对应关系，但不能鉴定miRNA 的靶位点[20]。而鉴定miRNA 靶位点最常用方法是双荧光素酶报告基因载体检测系统，其首先需双荧光素酶基因表达载体，将期望鉴定的miRNA 靶基因的3'-UTR 序列构建到含双荧光素酶的报告载体中，然后将重组的载体质粒和miRNA 共转染到细胞中，通过检测双荧光素酶活性来分析转染的靶基因3'-UTR 中是否含有miRNA 的靶位点[21-23]。Li 等[24]研究发现，miR-101a能够参与山羊肌细胞增殖和分化，最后通过双荧光素酶报告载体鉴定发现miR-101a 结合位点是zeste 同源物2（EZH2）的3'UTR。

4 miRNA 对肌肉发育的调控

4.1 miRNA 调控成肌细胞、骨骼肌卫星细胞增殖分化 成肌细胞和卫星细胞作为动物骨骼肌的主要组成成分，对骨骼肌的形成和再生具有重要意义，是研究骨骼肌体外生长发育基因调控机制的基础模型。研究发现miRNA 在成肌细胞和骨骼肌卫星细胞的增殖、分化等方面起重要作用[25-26]。miR-1、miR-133 和miR-206 是3 个在肌肉中特异性表达的miRNA。miR-l 可以促进成肌细胞的分化，而miR-133 则促进细胞的增殖[27]。miR-206 表现出与miR-l 相似的功能，即促进成肌细胞的分化[28-29]。在C2C12 细胞中的研究表明，miR-133 可促进细胞增殖，而miR-1 和miR-206 可增强细胞分化[30-31]，并且miR-1、miR-133 及 miR-27 都参与调控肌卫星细胞的静息状态进而影响骨骼肌的再生过程。如成年动物肌肉发生肌损伤后，位于受伤部位的肌源细胞受到巨噬细胞的刺激开始增殖[32]，此时位于基膜下的肌卫星细胞被激活重新进入细胞周期进行增殖并分化，参与肌肉的恢复[33]。此外，miR-486、miR-181、miR-26a 和miR-24 等非肌肉特异性表达的miRNA 对骨骼肌卫星细胞的增殖分化也存在重要的调控作用[34-35]。如miR-203 通过靶向c-JUN 抑制骨骼肌细胞的增殖并且通过靶向MEF2C 抑制骨骼肌细胞的分化[36]。miR-24、miR-26a、miR-322/424、miR-503 和miR-486 对成肌细胞分化显示出正调节作用[37]，miR-221、miR-222 和miR-125b 则被发现产生相反的效果[38]。许多研究证实miRNA可以通过与MRFs 基因家族（MyoD、Myf5、MyoG 和MRF4）、PAX 基因家族（Pax3、Pax7）和MEF2 基因家族（MEF2A、MEF2B、MEF2C、MEF2D）等重要转录因子相互作用调控细胞增殖分化过程。Nakasa 等[39]发现在肌损伤部位过表达miR-1、miR-133 和 miR-206能加快骨骼肌再生，并上调生肌标志基因 MyoD、MyoG 和 Pax7的 mRNA 和蛋白水平的表达。小鼠（Mus musculus）骨骼肌卫星细胞分化过程中 miR-1/206 与 Pax7 蛋白呈相反表达，而且miR-1/206 通过靶向Pax7基因抑制骨骼肌卫星细胞增殖，促进成肌分化[40-43]。此外，miRNA 还能够参与信号通路，如JNK/MAPK 信号通路、P38/MAPK 信号通路、Wnt 信号通路[44]、p53 信号通路等来影响细胞增殖分化。如miRNA 可以调控JNK/MAPK 和P38/MAPK 信号通路调控成肌细胞分化[45]。miR-16-5p 能够靶向SESN1以调节p53 信号传导途径，并因此影响成肌细胞增殖和凋亡[46]。miR-487b-3P 在山羊肌肉组织的表达显著高于其他组织，并且在胎儿期山羊肌肉组织比成年期羊的组织表达量高，靶向IRS1 的3'-UTR 通过PI3K/Akt 和MAPK/Erk 途径影响成肌细胞增殖分化从而调节肌肉生成[47]。就反刍动物而言，山羊miRNA 与牛在结构上具有高度的相似性。研究发现miR-143、miR-378 能够分别靶向IGFBP5和POLA2基因调节牛骨骼肌卫星细胞增殖和分化[48-49]，miR-208b 通过CDKN1A的转录后下调参与牛原代骨骼肌细胞的细胞周期和增殖的调节[50]，但这些miRNA 在山羊上是否具有相同的功能需要进一步进行验证。相比其他物种，山羊中关于miRNA 与骨骼肌发育的研究目前还较少，更多miRNA 与骨骼肌发育之间的关系还有待进一步研究。总的来说，成肌细胞和卫星细胞增殖、分化过程需要多种因子的共同调控，而miRNA 参与其调控并发挥了重要作用。

4.2 miRNA 调控肌纤维转化及代谢 众所周知，动物骨骼肌肌纤维的发育在动物胚胎期基本就已经完成，动物出生后肌纤维经过一个成熟过程，主要是肌纤维的肥大和肌纤维的转化。因此，肌纤维代谢和收缩类型转变是动物骨骼肌发育过程中的一个重要阶段。Rooij 等[51]研究发现，肌球蛋白基因Myh6、Myh7和Myh7b不仅能够编码肌肉的主要收缩蛋白，而且能够通过编码控制肌肉基因表达和性能的内含性miRNA（miR-208a、miR-208b、miR-499）来更广泛地影响肌肉功能。Tnni1和Tnni2通常被认为是慢肌纤维和快肌纤维的标志基因。Gan 等[52]研究发现，在小鼠骨骼肌组织中过表达 miR-499，Tnni1基因表达量显著上调，Tnni2基因表达显著下调，表明 miR-499 能够参与骨骼肌的快慢肌肌纤维转换。另外，在小鼠C2C12 细胞中发现，miR-1 能够靶向Cox1、ND1基因参与线粒体内的氧化磷酸化反应上调细胞线粒体能量代谢[53]。在β3 羟基-β-甲基丁酸（HMB）的诱导作用下，miR-199-3p 靶向TEAD1能够促进HMB 引起的慢肌纤维和快肌纤维类型之间的转换作用[54]。Zhang 等[55]研究发现，敲除小鼠体内的miR-133a 后，小鼠在 12 周时体重和肌肉重量都小于野生对照小鼠，而且肌肉中线粒体活性下降，表明 miR-133a负调节小鼠骨骼肌生长及能量代谢。miR-130b 可以通过直接靶向长链非编码RNA MyHC IIA 3'-UTR 来调控肌发生，并维持快肌纤维的表型[56]。miR-130 也通过靶向 Pgc-1α负调节骨骼肌细胞能量代谢[57]。这些研究表明miRNA 通过参与调控快慢肌纤维转换及能量代谢进而影响骨骼肌的生长发育。

4.3 miRNA 参与肌肉异常发育 大量研究还发现一些肌肉发育异常与miRNA 的异常表达相关。肌肉肥大和肌肉萎缩是临床上常见的2 种肌肉疾病。Eisenberg 等[58]曾在10 个不同的肌肉功能紊乱的案例中检测到185 种miRNA 表达的变化。Mccarthy 等[59]通过功能超负荷诱导首次证明了肌肉miRNA 在骨骼肌肥大中起关键作用。横纹肌瘤是由未成熟肌细胞增殖导致的一种癌症，研究证实miR-29 与横纹肌瘤有关[60]。最近的研究显示，杜氏肌营养不良主要是由于miR-1 抑制HDAC2的表达，使G6PD 表达过量造成的[61]。miR-1 的表达异常与多种疾病有关，包括肿瘤、炎症、糖尿病等[62]。

图2 miRNA 参与骨骼肌发育调控的模式图

5 结语与展望

骨骼肌的发育过程涉及一系列复杂的生命活动，是起正、负调控作用的激素和因子以多种多样的复杂方式精确调控的结果，miRNA 是参与其调控过程的重要成员。近年来，miRNA 的研究手段不断地更新，一些新兴技术代替了传统的研究手段。但是由于miRNA 调节机制的复杂和下游靶基因筛选困难，目前有关 miRNA 对肌肉影响的研究依然具有一定的局限性。随着生物技术的发展与成熟，今后必将有更多的新兴技术不断涌现，使其能够更精准地对miRNA 在骨骼肌发育过程的调节机制进行全面解析，从而为提升畜牧生产的效益提供科技支撑。