鸡PIK3C2A 基因第6 内含子多态性及其与体尺和屠体性状的关联分析

杨丕才 ，刘 珂，曹海月，刘虹华，温娅娅，毛海光，尹兆正*

(1.云南省景东彝族自治县动物卫生监督所，云南景东 676200；2.浙江大学动物科学学院，浙江杭州 310058)

磷脂酰肌醇-4-磷酸3-激酶催化亚基2 型α（PIK3C2A）属于磷脂酰肌醇3 激酶（PI3Ks）家族，该家族是一类参与肌醇磷酸化的激酶，共三类亚型，可由生长因子、激素和细胞因子激活，进而控制细胞生长、增殖和代谢[1-2]。PIK3C2A是PI3Ks 家族Ⅱ类成员之一，参与磷脂酰肌醇（PI）的磷酸化，对生长和骨骼形成起关键作用[3]。同时，PIK3C2A也是哺乳动物PI3K/Akt 通路的关键基因之一，通过抑制TSC2 蛋白活化雷帕霉素靶蛋白（mTOR），促进细胞体积增长和数目增加，与肌肉质量和强度显著相关[4]。史新娥等[5-8]研究表明，阻断PI3K 信号通路可磷酸化激活FoxO1，从而抑制骨骼肌卫星细胞分化。

体尺和屠体性状是衡量家禽生产性能和经济效益的重要指标之一，同时，也对家禽品种的鉴定和改良具有重要参考意义[9]。本实验团队在前期通过GWAS 初步筛选出了与宁海黄鸡和广西黄鸡屠体性状相关的候选基因PIK3C2A[10]，后期通过600K 基因芯片对宁海黄鸡和广西黄鸡PIK3C2A基因多态性及其与屠体性状之间的相关性进行检测，发现在PIK3C2A基因内含子区域的38 个SNPs 中，宁海黄鸡的7 个SNPs 和广西黄鸡的6 个SNPs 分别与部分屠体性状显著相关（P<0.05 或P<0.01）（未发表）。鉴于PIK3C2A基因在生长和骨骼形成方面具有重要的功能，在鸡中开展对该基因多态性的相关研究就显得尤为重要。因此，本研究以无量山乌骨鸡为研究对象，探究PIK3C2A基因多态性与无量山乌骨鸡体尺和屠体性状的相关性，以期为无量山乌骨鸡的分子标记选育工作提供一定的理论参考。

1 材料与方法

1.1 样品采集和方法 本实验所用300 日龄无量山乌骨鸡由景东县龙街无量山乌骨鸡养殖专业合作社提供。分两批进行采样，共192 只。现场屠宰，颈部取血，血液用EDTA 抗凝，-20℃保存。

1.2 血液DNA 的提取 依据说明，使用TIANGEN 血液基因组DNA 提取试剂盒（天根，北京）提取基因组DNA，并采用NanoDrop2000 紫外分光光度计检测DNA样本的浓度及OD 值，A260/A280在1.8～2.1 范围内的DNA 用于后续基因测序及多态性研究。

1.3 实验方法

1.3.1 性状测定 按照中华人民共和国农业行业标准《肉鸡生产性能测定技术规范》(NY/T 828-2004) 进行体尺和屠体性状的测定。体尺性状包括：体斜长、胸宽、胸深、胸角、龙骨长、骨盆宽、胫长和胫围。实验鸡经活重和体尺测定后，立即进行屠宰测定。测定项目包括屠体重、半净膛重、全净膛重、胸肌重和腹脂重，并对屠宰率、半净膛率、全净膛率、胸肌率和腹脂率进行计算。

1.3.2 引物设计与合成 根据GenBank 上提供的鸡PIK3C2A基因序列（NC_006092.5），用Primer Premier 5.0设计引物，由杭州擎科梓熙生物技术有限公司合成，引物序列为F：GGAGAACAGCAAGTGCCAGGAC；R：CACACGCCAAAACACCAGCC，退火温度为53℃。

1.3.3 PCR 扩增 PCR 反应体系为50 μL：DNA 模板（50 ng/μL）2 μL，上下游引物（10 μmol/L）各2 μL，Taq Master Mix 25 μL，dd H2O 补至50 μL。PCR 扩增条件为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸1 min 30 s，循环数为35；72℃延伸10 min。扩增后用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR 产物。

1.3.4 测序和分型 扩增产物由杭州擎科梓熙生物技术有限公司采用直接测序法进行测序。根据测序结果，利用DNAStar 等生物学软件进行序列比对，筛选SNPs，分析测序峰图，完成分型。

1.4 统计分析 利用Excel 计算各突变位点基因频率和基因型频率、多态信息含量（PIC）、杂合度（He）和有效等位基因数（Ne），并进行Hardy-Weinberg 平衡检验，采用SPSS21.0 一般线性模型（GLM）程序对各个突变位点与鸡体尺和屠体性状进行关联分析。使用最小二乘方差分析模型如下：

其中，Yijk为性状观察值；μ为群体均值；Gi为基因型效应；Bj为批次效应；ek为随机误差。实验数据以（平均值±标准误）表示，以P<0.05 为差异显著性判断标准。

2 结果

2.1 基因型频率、基因频率及群体遗传特性分析 测序结果显示，鸡PIK3C2A基因第6 内含子上共检测到5 个突变位点，分别为：g.38511T>A、g.38573C>T、g.38632T>C、g.38662A>G 和g.38729C>T。各突变位点的基因频率和基因型频率见表1。由表1 可知，各个突变位点均有3 种基因型。g.38511T>A 位点的优势基因型为AA，优势等位基因为A；g.38573C>T 位点优势基因型为CC，优势等位基因为C；g.38632T>C 位点优势基因型为TT，优势等位基因为T；g.38662A>G 优势基因型为AG，优势等位基因为A；g.38729C>T 位点优势基因型为CT，优势等位基因为C。卡方检验显示，各个位点均处于Hardy-Weinberg 平衡状态（P>0.05）。各位点的PIC 都处于0.25～0.50 之间，属于中度多态。各位点杂合度低，且有效等位基因数接近2，可见在该群体中等位基因分布较均匀。

2.2PIK3C2A基因多态性与体尺性状关联分析PIK3C2A基因5 个SNPs 位点与无量山乌骨鸡体尺性状的关联分析结果见表2。由表2 可知，在g.38511T>A 位点，TT基因型个体的龙骨长高于AA 型个体（P<0.05），TT基因型个体胸角高于TA 基因型个体（P<0.01），且TT 基因型个体的胫围高于TA 基因型个体（P<0.05）。在g.38573C>T 位点，CC 基因型个体的胸角和胫围都高于CT 基因型个体（P<0.05），但TT 基因型的盆骨宽高于CC 和CT 基因型个体（P<0.05）。在g.38632T>C位点，CC 基因型个体的胸角和胫围都高于TT 和TC 基因型个体（P<0.05）。在g.38662A>G 位点，GG 基因型个体的胸角高于AG 和AA 基因型个体（P<0.05），且GG 基因型个体的胫围高于AG 基因型个体（P<0.05）。在g.38729C>T 位点，TT 基因型个体的胸角高于CC型个体（P<0.05）和CT 基因型个体（P<0.01），且TT 基因型个体的盆骨宽高于CC 和CT 基因型个体（P<0.05）。各个突变位点与乌骨鸡体斜长、胸深和龙骨长均无相关性（P>0.05）。

2.3 多态性位点与屠体性状关联分析 由表3 可知，PIK3C2A基因g.38511T>A 位点的多态性与屠体率相关（P<0.05），其中AA 型个体的屠体率高于TA 型个体（P<0.05）。在g.38573C>T 位点，多态性与乌骨鸡屠体性状无相关性（P>0.05）。在g.38632T>C 位点，CC型个体的活重、屠体重、半净膛重和全净膛重均高于TC 型个体（P<0.05），而屠体率高于TC 型个体（P<0.01），且屠宰率、腹脂重和腹脂率高于TT 型（P<0.05）。在g.38662A>G 位点，GG 基因型个体的活重、屠体重、半净膛重和全净膛重高于AG 基因型个体（P<0.05），且屠体重、半净膛重、腹脂重和腹脂率高于AA 基因型个体（P<0.05），但AA 基因型个体的胸肌率高于GG基因型个体（P<0.05）。在g.38729C>T 位点，TT 基因型个体的活重、屠体重和半净膛重均高于CT 基因型个体（P<0.01），且全净膛重高于CT 基因型（P<0.05），但胸肌率低于CC 基因型个体（P<0.05）。

3 讨 论

3.1 基因型频率、基因频率及群体遗传特性分析 近些年来，关于鸡基因鉴定及其与经济性状关联的研究越来越多。在畜禽分子育种中候选基因法是当前育种工作者常采用的手段之一，通过分子标记筛选，家禽主要经济性状得到了很大的改善[11-14]。PIK3C2A基因多态性与鸡体尺和屠体性状的相关性研究甚少，本实验团队在前期采用600KSNP 芯片分析了宁海黄鸡和广西黄鸡两个国内优质地方鸡种PIK3C2A基因多态性及其与屠体性状之间的相关性，发现其内含子区域有与屠体性状显著相关的SNPs（未发表）。因此，该实验通过分析无量山乌骨鸡PIK3C2A基因内含子的多态性，试图发现其与鸡体尺和屠体性状的相关性。本实验在无量山乌骨鸡PIK3C2A基因第6 内含子处共检测到5 个突变位点，均处于中度多态（0.25

表1 基因型频率和等位基因频率及群体遗传特性

表2 PIK3C2A 基因SNPs 与无量山乌骨鸡体尺性状的关联分析

表3 PIK3C2A 基因第6 内含子SNPs 与无量山乌骨鸡屠体性状的关联分析

3.2PIK3C2A基因多态性与鸡体尺性状的相关性 有研究表明，PI3K 信号通路可以激活丝氨酸/ 苏氨酸激酶AKT1、AKT2和AKT3。其中AKT1是与生长相关的基因；AKT2在骨骼肌、肝脏和脂肪等组织高表达[15-16]。有研究发现，PI3K/Akt 信号通路对胚胎鸡成肌细胞增殖和骨骼肌生长有重要意义[17]。因此推断，PIK3C2A基因多态性可能与体尺性状有相关性。王利娜[18]等人研究发现，PIK3CA基因的c.3068 A>G 与欧洲大白兔和福建黑兔生长性状显著相关。目前，有关鸡PIK3C2A基因的多态性与体尺性状的研究还尚未报道，本实验首次探究了无量山乌骨鸡PIK3C2A基因的多态性与体尺性状的关联性。结果显示，5 个突变位点均与体尺性状有相关性（P<0.05）。此外，在g.38662A>G 和g.38729C>T 位点，突变后的基因型个体的胸角和胫围均高于未发生突变的基因型个体（P<0.05）。因此，可初步认为PIK3C2A基因多态性与鸡体尺性状具有相关性。

3.3PIK3C2A基因多态性与鸡屠体性状的相关性 家禽的屠体性状也是重要的经济性状之一，屠宰率和全净膛率是衡量家禽产肉性能的主要标志[19]。本实验结果显示，在g.38632T>C 位点，CC 基因型个体的活重、屠体重、半净膛重和全净膛重均显著高于TT 和TC 基因型个体（P<0.05），但TT 基因型的腹脂重和腹脂率较低，这可能是与PI3K 信号通路激活的AKT2在脂肪组织中高表达有关[20-21]。该基因与腹脂性状密切相关，可能与鸡腹脂性状的主效基因或与控制该性状的主效基因连锁。在g.38729C>T 位点，TT 基因型个体的活重、屠体重和半净膛重均极显著高于CT 基因型个体（P<0.01），且具有较高的全净膛重，但胸肌率显著低于CC 基因型个体（P<0.05）。综合以上实验结果，推断g.38632T>C和g.38729C>T 这2 个位点可能是影响无量山乌骨鸡屠体性状的关键位点。

4 结 论

本研究发现，在无量山乌骨鸡PIK3C2A基因第6 内含子处共检测到5 个多态位点。对各多态位点与体尺性状和屠体性状进行关联分析，在体尺性状上，5 个位点均与体尺性状具有相关性；在屠体性状上，除g.38573C>T 位点与屠体性状无显著相关性外，其余各位点均与屠体性状相关（P<0.05 或P<0.01）。由此推测，PIK3C2A基因可作为鸡体尺性状和屠体性状的分子标记辅助选择的候选基因。