敖汉细毛羊Noggin 基因质粒的构建及其在成纤维细胞中表达量的研究

荣 恒，张梦瑶，柳 楠，李 晶，贺建宁*

（1.青岛农业大学动物科技学院，山东青岛 266109；2.曲阜市畜牧兽医技术服务中心，山东济宁 273100）

随着人们生活水平的提高，对羊毛的需求量不断增加，对羊毛产量、质量的研究也显得越来越重要[1]。羊毛是毛囊的衍生物，同时羊毛的产量和质量取决于毛囊的性质和结构[2]。因此，想要更好地控制羊毛的性状发育特征，需要对毛囊发育规律和结构特征进行研究[3]。Noggin基因在1992 年首次被发现，由Smith 等[4]从非洲爪蟾的胚胎中分离得到。McMahon 等[5]于1998 年发现Noggin 作为一种重要的胚胎蛋白，其在小鼠的节点、脊索和背侧体节表达，并且发现它对神经管的生长有重要作用。与此同时，Noggin基因在胚胎发育过程中对神经有重要诱导作用，主要诱导外胚层的背侧发育[6]。Noggin基因不仅在神经系统发育中发挥关键作用，还是骨骼发育[7]、卵巢发育[8]和心脏中隔形成[9]等过程的重要调控基因。Noggin 可与骨形态发生蛋白结合，阻止其与相应受体结合，直接拮抗BMP4、BMP7、BNP2等基因，从而抑制BMP 信号通路[10]。资料显示[11]，BMP基因家族在毛囊发育过程中起重要的抑制作用，如BMP2基因在毛囊生长的休止期表达量最高。而Noggin基因作为BMP 基因家族的抑制剂，在很多方面的功能作用都是基于抑制BMP 基因家族的活性从而对毛囊发育发挥间接的促进作用。其次Noggin作为抑制剂诱导次级毛囊发育[12]，如果Noggin基因缺失，可能出现光秃现象。

目前，关于Noggin基因的研究大多集中于调节肿瘤、癌症等方面，与细毛羊毛囊有关的较少。而对于毛囊相关的基因研究，大部分仅在分子水平上对其功能进行了验证。因此，本实验对Noggin基因在细胞中的表达量进行研究，有助于进一步了解Noggin对羊毛产生的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取40 日龄的敖汉细毛羊健康胎羊（由青岛畜牧所奥特种羊场提供）并及时消毒处理。

1.2 实验试剂及仪器 TRIZol（Roche）试剂、蛋白裂解液、Nhel、Kpnl限制性内切酶、T4 DNA 连接酶、T载体、pcDNA3.1 质粒、DH5α感受态细胞、DMEM（基础培养基）、胰蛋白酶、标准胎牛血清、DPBS（磷酸缓冲盐溶液）、Lipofectamine 2 000、反转录试剂盒、切胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、培养皿等均购自青岛尚赛科贸有限公司。BB5060UV 型贺氏二氧化碳培养箱购于德国Eppendorf 公司，LG16-W 高速微量离心机、Leica DMIRB 型倒置显微镜购于青岛鑫恒一有限公司，BSW-1360V 垂直洁净工作台购于青岛赛尚科技有限公司，Redbio CFX ConnectTM荧光定量PCR 系统购自Bio-Rad 公司。

1.3 实验方法

1.3.1 PCR 扩增 RNA 提取并反转录后，根据NCBI 收录的绵羊Noggin基因组序列（登录号为NM_00117411 0.1）CDS 区外侧通过Primer 5.0 设计引物，并在上游引物和下游引物的5'末端分别添加NheI、KpnI限制性酶切位点及保护碱基（下划线序列）。完成后的引物序列为：上游引物：5'-CTAGCTAGCACAGACCTTCTGCC TCACTACC-3'；下游引物：5'-CGGGTACCTTCACCG GACGATCCTTCT-3'。通过PCR 扩增后进行琼脂糖凝胶电泳检测，体系为25 μL：DNA 模板1 μL，上下游引物各1 μL，Green Mix 12.5 μL，ddH2O 9.5μL。

1.3.2 TA 克隆 DNA 通过琼脂糖凝胶电泳切胶回收，T载体连接体系为：T4 DNA 连接酶1 μL，T4 DNA 连接酶Buffer 1 μL，T 载体2 μL，目的片段6 μL；混匀置于26℃金属浴中2 h 后4℃过夜，将10 μL T 连接液加入到100 μL DH5α感受态细胞中，混匀后冰上静置15 min；42℃热激90 s 后重新冰上静置20 min；加入800 μL LB基础培养基（不含AMP 抗生素）37℃、200 r/min 震荡培养1 h，离心后去除上清，吹打混匀细胞，将细胞涂布在含AMP 抗生素的平板上，在37℃条件下培养12 h，然后挑单菌摇菌后测序。

1.3.3Noggin基因与pcDNA3.1 载体连接 利用Nhel、Kpnl限制性内切酶对TA 克隆载体及pcDNA3.1 载体同时进行双酶切，体系为：Nhel限制性内切酶1 μL，Kpnl限制性内切酶1 μL，TA 克隆载体和pcDNA3.1 10 μL，Buffer1 μL，补水至50 μL 体系；37 ℃ 3 h，通过琼脂糖凝胶电泳对Noggin基因及切开的pcDNA3.1质粒进行切胶回收，取5 μLNoggin基因液体，4 μL pcDNA3.1，加入到含有1 μL T4 DNA 连接酶及1 μL T4 DNA 连接酶Buffer 的PCR 管中22 ℃ 2 h，之后16℃反应3 h，最终转至DH5α感受态细胞，选取摇菌后的单菌落对其进行阳性率测定，经测序、质粒提取获得阳性质粒。

1.3.4 成纤维细胞的培养 用75%酒精浸洗两遍从羊场取回的40 日龄胎羊（自母羊妊娠后40 日龄的未出生羊）之后，在培养皿中用75% 的酒精再次清洗3 遍，最后用含有双抗的PBS 反复清洗3 遍。之后用剪刀剪掉头部和四肢，然后将躯干剪成1.5 mm3左右，将其放在培养皿，加胎牛血清，在CO2浓度为0.05、温度37℃的培养箱中培养4 h，再加培养液。从培养箱取出24 h 后，用PBS 冲洗干净，更换培养液，定时观察。细胞生长到95%左右进行传代培养。

1.3.5 细胞转染 在传代后2 代进行转染。用Lipofecta mine 2 000 进行瞬时转染，实验组和对照组分别加20 μL脂质体试剂和480 μL DMEM（不含双抗），混匀，静置10 min，在实验组中加入40 μL 构建好的表达载体和460 μL DMEM（不含双抗），对照组仅加入500 μL DMEM，静置20 min，然后将实验组和对照组都移到培养皿中均加入4 mL DMEM，在37℃条件下，培养6 h后换液，之后培养36 h。

1.3.6 细胞转染后的RT-PCR 扩大培养转染成功的单细胞，细胞在培养皿底部长到95% 时，每个板加TRIZol（Roche）试剂3 mL，细胞裂解后进行RNA 提取。RNA 提取完成后，测定浓度和纯度符合标准后将其反转录成cDNA。通过Primer Premier 5.0 软件设计Noggin和GAPDH基因的引物序列见表1。实时荧光定量PCR 反应程序：95℃预变性7 min；95℃变性40 s，60℃退火40 s，72℃延伸30 s，共45 个循环。样品各进行3 次重复，采用Ct（2－ΔΔCt）值法计算Noggin相对于内参基因GAPDH的表达量。利用SPSS17.0 软件中t检验对数据进行分析。

表1 引物信息

1.3.7 细胞转染后Western Blot 检测Noggin基因蛋白表达 利用蛋白质印迹法（Western Blotting）将样品分为实验组和对照组，每组3 个生物学重复。先裂解提取细胞中的蛋白质，内参基因GAPDH、目的基因Noggin分别点3 个胶孔，电泳后对蛋白质进行PVDF 转膜，用转膜电泳槽进行2～3 h，之后封闭蛋白质2 h；TBST 洗膜3 次，每次5 min；按1:2 000 的比例对一抗进行稀释，在4℃冰箱用一抗孵育PVDF 膜12 h；用TBST 洗膜3次，每次5 min。按1:2 000 的比例稀释二抗，孵育1.5 h；在暗室中曝光。用Image J 软件分析条带，结果用SPSS统计分析软件进行分析。

2 结果

2.1Noggin目的基因扩增 图1 为PCR 后凝胶电泳分析结果（2%琼脂糖凝胶），结果显示扩增条带单一明亮，大小位于699 bp 处，与已知大小一致。

图1 Noggin 基因PCR 扩增

2.2 克隆载体的提取 对pGM-T-Noggin进行提取，结果如图2 所示，pGM-T 载体大小为3 015 bp、目的基因大小为699 bp，连接后条带位于3 714 bp 处，与已知大小相符，表明克隆载体连接并提取成功。

图2 克隆载体的鉴定

2.3 TA 克隆测序比对 图3 为测序后比对结果，碱基没有发生突变，可用于后续实验。

2.4 克隆载体、pcDNA3.1 表达载体双酶切 图4 为双酶切结果，目的基因为699 bp，pGM-T 为3 015 bp，表达载体pcDNA3.1 为5 427 bp。图4 所示条带与以上数据相符合，酶切成功。

2.5 表达载体pcDNA3.1 构建及鉴定 菌液PCR 结果如图5 所示，在699 bp 位置处有明亮清晰且单一的条带，证明pcDNA3.1-Noggin构建成功。

2.6 细胞培养 细胞生长观察结果如图6 所示，其中原代培养细胞为梭形、圆形，此外还有一些游离组织；传代培养细胞全部为成纤维细胞，形态上为梭形。

2.7 实时荧光定量PCR 检测mRNA 的表达 从转染后的成纤维细胞中提取RNA 后反转录成cDNA，以其为模板对目的基因Noggin和内参基因GAPDH片段同时进行PCR 扩增。2%琼脂糖凝胶电泳结果如图7 所示，扩增的条带单一明亮，GAPDH产物大小为125 bp、Noggin产物大小为128 bp，与已知大小均相同，可继续实时荧光定量PCR 实验。

图8 为实时荧光定量扩增曲线和熔解曲线，曲线清晰且只有一个峰值，表明在实时荧光定量PCR 过程中无二聚体且得到了特异性的扩增产物，可用来进行定量分析。利用SPSS 对2 组mRNA 的表达量进行测定和分析，结果如图9 所示，转染组极显著高于未转染组（P<0.01）。

2.8 Westren Blot 检测蛋白的表达 由图10 可知，转染的实验组条带明显比未转染的对照组粗，由Image J 软件分析灰度值，灰度值用SPSS 分析。由图11 可知，转染组Noggin 表达量极显著高于未转染的对照组，表明质粒pcDNA3.1-Noggin能高效表达Noggin基因。

3 讨 论

关于毛囊的研究以往主要集中在出生后和成年绵羊身上[13]，Stenn 等[14]在成年绵羊身上对毛囊的周期性生长变化展开研究；近年来，柳楠等[15]在分子水平上研究了敖汉细毛羊羊毛性状形成的机理；王小佳等[16]在分子水平上探究了羊毛的生长部位。由于大多数前人研究都集中在分子水平上，而在细胞水平上与毛囊生长发育相关的研究甚少。因此本实验选择在细胞水平上对Noggin基因功能进行验证。

Noggin 作为一种重要的胚胎蛋白，对神经管的生长具有重要作用，在胚胎发育过程中起神经诱导作用，近年来发现它对多个系统有影响。范晓棠等[17]研究发现Noggin基因在大鼠神经系统发育过程中表达，也是骨骼发育过程中的重要调节因子。BMPs 可以促进骨生长，增加骨量，可治疗骨量减少所引起的疾病，例如骨折和骨质疏松等，但如何控制BMPs 的量则需要Noggin等因子来调节。

图3 TA 克隆测序比对

图4 克隆载体及pcDNA3.1 载体双酶切

图5 表达载体pcDNA3.1 的鉴定-PCR 扩增

图6 成纤维细胞原代、传代培养

图7 内参基因GAPDH（A）目的基因Noggin 扩增产物(B)

图8 Noggin 和GAPDH 熔解曲线峰值图（A）和扩增曲线图(B)

图9 Noggin 基因mRNA 相对表达量

图10 实验组和对照组蛋白表达条带

图11 Noggin 蛋白相对表达量

1999 年，Botchkarev 等[18]研究发现有2 种扰乱毛囊诱导并引起脱发的途径，BMP4 异位过表达和BMP抑制剂Noggin的靶向干扰。Noggin作为刺激HF 诱导的关键信号分子，主要通过2 种途径发挥作用，一种是与BMP4 拮抗作用，另一种是下调75 KD 神经营养因子受体。2002 年Botchkarev 提出了Noggin在雌性动物生产后 HF 生长期发挥作用。由他的研究可得知，无论是胚胎期还是出生后，Noggin都会中和BMP4 的抑制活性。在胚胎时期，Noggin就开始诱导HF[19]。Noggin对细胞内的 BMP 信号起抑制作用，BMP 信号被抑制，LEF1 信号则会表达，继而引起Wnt 信号的恢复。在这个循环过程中，毛囊干细胞中BMP 信号会随着Noggin的变化而产生相应的变化，从而导致生长周期的启动。因此，本实验通过对目的基因Noggin的克隆，并构建其表达载体。通过转染实验后对mRNA 及蛋白的表达量进行测定，结果表明，实验组表达量均极显著高于对照组。

4 结 论

本实验通过对目的基因Noggin的TA 克隆，表达载体pcDNA3.1-Noggin的构建，转染成纤维细胞后进行实时荧光定量PCR 技术和Westren Blot 技术检测Noggin基因在成纤维细胞中的表达，结果表明，实验组均极显著高于对照组，为今后Noggin功能的鉴定研究提供了基础。