4个瓦氏黄颡鱼群体遗传多样性的微卫星分析

郑 翔，徐杰杰，张佳佳，王 涛，尹绍武

( 南京师范大学 海洋科学与工程学院，江苏 南京 210023 )

瓦氏黄颡鱼(Pelteobagrusvachelli)属鲇形目，鲿科，黄颡鱼属，主要分布于长江及其支流中。该品种不仅具有环境适应性强、耐低温、抗病力强和食性杂等优点，且肉质细嫩、味道鲜美、营养丰富、经济价值高[1-3]，在土著经济鱼类养殖的发展过程中越来越受到重视。由于长江流域瓦氏黄颡鱼大量捕捞，资源严重锐减，因此，采取各种措施保护长江流域的瓦氏黄颡鱼种质资源，是瓦氏黄颡鱼种质资源可持续发展的关键。深入研究该物种的遗传结构与遗传多样性是科学制定资源保护与开发规划的基础。迄今为止，关于瓦氏黄颡鱼的研究主要集中在其繁殖、养殖技术、低氧生理和营养价值分析等方面，对于我国瓦氏黄颡鱼遗传结构与遗传多样性的研究尚未引起重视。而瓦氏黄颡鱼主要分布于我国长江水域。笔者选取长江上、中、下流域共4个支流的瓦氏黄颡鱼群体为研究对象，探究不同地区瓦氏黄颡鱼群体的遗传多样性，以期为长江水系瓦氏黄颡鱼的保护性开发、良种选育等提供理论依据。

微卫星DNA又称为短串联重复序列或简单重复序列[4]，是一种在真核生物基因组中广泛分布的DNA片段。每个微卫星DNA均由核心序列和侧翼序列两部分组成，其核心序列呈串联重复排列，侧翼序列为单拷贝序列，位于核心序列的两端，具有保守性，能特异地将不同的微卫星定位于基因组特定部位。利用微卫星侧翼序列的保守性及核心序列的高突变性、拷贝丰富性设计引物，可通过对基因组DNA进行PCR扩增，来探究物种内微卫星位点的多态性。随着国内外学者对其结构、遗传特性及发生机理等研究的不断深入，微卫星技术在构建遗传连锁图谱、定位数量性状座位、评估遗传多样性、绘制系统发生树、疾病诊断及血缘关系鉴定等[5-8]方面显示出巨大优势，并因其数量多、分布广、多态性丰富及检测快速方便而广泛应用于生物遗传多样性的研究。目前，国内外关于黄颡鱼属鱼类的微卫星标记研究主要集中在黄颡鱼(Pelteobagrusfulvidraco)，而关于瓦氏黄颡鱼的微卫星标记鲜见报道。刘红艳等[9]采用10个微卫星位点对长江中、下游5个湖泊和云南抚仙湖黄颡鱼群体的遗传结构进行了分析；李景芬等[10]采用筛选的6个微卫星标记分析了黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼以及黄颡鱼(♀)×瓦氏黄颡鱼(♂)杂种一代3个群体的遗传特征；张秀杰[11]对采集于4个水系的12个野生黄颡鱼群体的遗传结构和遗传多样性进行了分析，并采用扩增片段长度多态性(AFLP)标记和微卫星标记构建了黄颡鱼的第一代遗传连锁图谱；孔艺[12]采用链霉素磁珠法分离筛选微卫星标记，分析了长江中下游部分黄颡鱼群体的遗传多样性。

笔者利用筛选出的25对多态性较高的微卫星引物对嘉陵江、沅江、汉水、赣江4个瓦氏黄颡鱼群体进行遗传多样性比较分析，为不同瓦氏黄颡鱼群体遗传评估和新品种选育提供了理论基础和参考资料。

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料为嘉陵江(位于长江上游)瓦氏黄颡鱼野生群体32尾，沅江(位于长江中游)瓦氏黄颡鱼野生群体32尾，汉水(位于长江中游)瓦氏黄颡鱼野生群体31尾，赣江(位于长江下游)瓦氏黄颡鱼野生群体32尾，共127尾瓦氏黄颡鱼个体。具体地理位置见表1、图1，分别取127尾个体的尾鳍保存于无水乙醇中，置于冰箱中-20 ℃冷藏备用。

表1 4个瓦氏黄颡鱼群体的采样信息

图1 4个瓦氏黄颡鱼群体的地理位置

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA的提取及检测

使用上海捷瑞生物公司的细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)进行瓦氏黄颡鱼DNA的提取，将提取的DNA经 1%的琼脂糖凝胶电泳(电压120 V，电流165 A，时间22 min)检测，在凝胶成像仪中拍摄电泳图片观测样品DNA的完整性与纯度，最后置于-20 ℃保存备用。

1.2.2 微卫星引物

自瓦氏黄颡鱼转录组EST序列筛选获得80个微卫星位点，经过电泳仪条带检验其中有48对能够在4个群体中稳定扩增，挑选等位基因数较多、多态性较好的25对引物用于瓦氏黄颡鱼群体的遗传分析，试验所采用的引物及4种荧光染料(FAM、HEX、TAMRA及ROX)(表2)由擎科生物公司(南京合成部)合成。

表2 试验所采用的25对微卫星引物的特征

(续表2)

1.2.3 PCR扩增及检测

25对引物分别对4个瓦氏黄颡鱼群体DNA基因组进行PCR扩增。PCR扩增体系为：10 μL反应体系含模板1 μL DNA，5 μL 2×Taq Mix，10 μmol/L正向引物0.04 μL，10 μmol/L反向引物0.16 μL，10 μmol/L荧光基因0.16 μL，和3.64 μL ddH2O。PCR扩增的反应程序：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s、53 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，共35个循环；72 ℃延伸5 min；4 ℃保存。PCR扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，将检测到有单一条带的产物上样于ABI3500xl分析仪(上海生工公司)进行毛细管电泳，检测产物片段大小。

1.3 数据分析

利用GeneMarker 1.97软件分析微卫星位点的片段长度；利用POPGENE 1.32软件分析微卫星位点的等位基因数、有效等位基因数、观测杂合度、期望杂合度、Nei氏遗传距离以及遗传相似度；利用PIC_CALC计算多态信息含量(PIC)；根据群体间的Nei氏遗传距离，用MEGA 5.0软件非加权组平均法构建群体间聚类图；利用Arqlequin 3.1计算成对遗传分化指数并进行分子方差分析；利用Structure 2.3.4软件进行群体间的贝叶斯聚类分析。

2 结果与分析

2.1 4个瓦氏黄颡鱼群体的遗传多样性分析

用经过筛选的微卫星引物对4个瓦氏黄颡鱼群体127尾个体分别进行遗传多样性分析，25个位点中的等位基因数、有效等位基因数、观测杂合度、期望杂合度、多态信息含量及其各个群体的平均值见表2。汉水群体的平均有效等位基因为3.578、平均期望杂合度为0.674、多态信息含量为0.624，在4个瓦氏黄颡鱼群体中最高。相反，嘉陵江群体的平均有效等位基因为2.383、平均期望杂合度为0.487、多态信息含量为0.431，在4个瓦氏黄颡鱼群体中最低。

(续表3)

(续表3)

(续表3)

2.2 4个瓦氏黄颡鱼群体的遗传距离和遗传相似度

瓦氏黄颡鱼群体间Nei氏遗传距离为0.641～2.140，遗传相似度0.073～0.525(表3)。其中沅江和汉水的群体间的遗传距离最近(0.641)，遗传相似度最高(0.525)，而嘉陵江和赣江群体之间的遗传距离最远(2.140)，遗传相似度最低(0.073)。

表3 4个瓦氏黄颡鱼属鱼类的遗传多样性信息

2.3 4个瓦氏黄颡鱼群体的聚类分析结果及方差分析

依据4个瓦氏黄颡鱼群体的遗传相似系数和遗传距离(表4)，用非加权组平均法对4个群体进行聚类分析，结果显示，沅江和汉水瓦氏黄颡鱼群体先聚为一类，然后和嘉陵江瓦氏黄颡鱼聚为一类；赣江瓦氏黄颡鱼单独聚为一类。由于沅江和汉水均位于长江中游，相互连通，很可能水域之间的连通及地理位置是影响其聚类的原因(图2)。

图2 4个瓦氏黄颡鱼群体的聚类分析

表4 4个瓦氏黄颡鱼群体的Nei氏遗传距离与遗传相似度

分子方差分析结果(表5)表明，群体中有31.04%(P<0.01)的遗传变异来自于群体间，68.96%(P<0.01)的遗传变异来自于群体内，表明遗传变异大部分存在于个体之间，群体内的遗传变异大于群体间的遗传变异。4个瓦氏黄颡鱼群体间的遗传分化指数为0.1613～0.4020(表6)，属于较高水平遗传分化(遗传分化指数>0.15)。其中嘉陵江瓦氏黄颡鱼群体和赣江瓦氏黄颡鱼群体之间的遗传分化水平最低，遗传分化指数0.1613，属于较大程度的分化(0.15<遗传分化指数<0.25)。而嘉陵江瓦氏黄颡鱼群体和汉水瓦氏黄颡鱼群体之间遗传分化水平最高，遗传分化指数0.4020，两者间的分化程度极大(遗传分化指数>0.25)(表6)。

表5 4个瓦氏黄颡鱼群体的方差分析

表6 4个瓦氏黄颡鱼群体的遗传分化指数

利用Structure 2.3.4软件对4个瓦氏黄颡鱼群体25个微卫星座位等位基因数据进行贝叶斯聚类分析与遗传结构推导分析(图3)。按照文献[13]计算最优K值的方法，得到当K=3时，沅江和汉水群体在遗传结构上相似，可为一类；嘉陵江和赣江各为一类。

图3 4个瓦氏黄颡鱼群体的Structure 2.3.4遗传结构

3 讨 论

遗传多样性是衡量群体的资源丰富状况的一个重要根据，也是物种在应对不同的环境条件下能保证稳定存活和遗传进化的基础[14]。群体的遗传多样性程度与对环境的适应能力、自身进化的潜力呈正相关[15-17]。微卫星标记之所以成为当前研究者最为常用的分子生物学方法之一，是因其微卫星具有按照孟德尔方式分离、呈共显性遗传、在数量方面没有生物上的限制、多态性高和引物通用性强等优点[18-19]。本研究中的80对瓦氏黄颡鱼微卫星引物，其中能在4个瓦氏黄颡鱼群体进行有效扩增的有48对，扩增率达60%，扩增结果较为良好。在本研究中选用25对多态性较高的微卫星引物对4个群体进行遗传分析，可为瓦氏黄颡鱼群体遗传多样性分析和遗传资源的收集、鉴定、保护和合理利用提供资料。

3.1 多态信息含量及基因杂合度的影响

多态信息含量用来描述微卫星位点遗传变异程度，含量的高低与变异程度成正比。根据文献[20]的划分标准，在某一群体中，当多态信息含量>0.5时，该位点表现为高度多态；当0.25<多态信息含量<0.5时，该位点表现为中度多态；当多态信息含量<0.25时，该位点表现为低度多态。本研究中，嘉陵江、沅江、汉水、赣江4个群体得到的平均多态信息含量为0.431～0.627，表现为高度多态的位点分别为9、11、23、21个，中度多态的位点分别为12、11、3、5个。表明瓦氏黄颡鱼群体的微卫星侧翼序列在同种间具有保守性，其遗传变异程度高，遗传多样性比较丰富，并且良种选育潜力在汉水群体中表现的尤为突出。

基因杂合度是衡量群体遗传变异的最适参数，代表着群体中杂合子在某个位点上的频率，体现群体的进化程度[21]。Takezaki等[22]通过对微卫星标记的研究发现，群体具有遗传多样性的基础是杂合度的数值>0.3。杂合度可分为观测杂合度和期望杂合度，当观测杂合度值与期望杂合度值相近时，表明外部环境选择及近交等因素对该物种遗传变异情况的影响较小，此时群体内处于遗传平衡状态[23]。也可根据公式d=(Ho-He)/He(Ho为观测杂合度，He为期望杂合度)判断群体的遗传变异状态，其中d为每个群体的遗传偏离指数，当d值靠近0时，说明基因型分布接近于平衡状态；当d值偏离0时，说明基因型分布偏离平衡状态，d值大于0时说明杂合子过剩，d值小于0时说明杂合子缺失。本研究中检测的瓦氏黄颡鱼嘉陵江、沅江、汉水和赣江群体的平均观测杂合度分别为0.460、0.494、0.581、0.491，平均期望杂合度分别为0.487、0.532、0.674、0.665，表明4个地理群体瓦氏黄颡鱼均具有较高的遗传多样性，有较好的选育潜力。4个地理群体平均观测杂合度比平均期望杂合度低，推测可能是由于近交情况的普遍存在而使群体发生纯合，进而导致杂合度降低。嘉陵江群体的期望杂合度值略低于其观测杂合度，说明该群体相对于其他3个群体来说遗传性较为稳定。相反，赣江群体的观测杂合度和期望杂合度相差最大，原因可能是该地区有大量养殖个体放流，由于具有单一的遗传背景，逃逸的养殖个体与野生种进行杂交使杂合子缺失，从而使遗传平衡遭到破坏。因此，在繁殖选育过程中应尽量扩大选育范围，避免具有同样遗传背景的群体之间的交配，也要防止大量养殖个体的放流逃逸。此外，影响试验结果的因素也可能是多态性微卫星位点的挑选和取样数量的多少。

3.2 遗传距离与遗传相似系数的影响

遗传距离是衡量群体间遗传关系的指标，遗传相似系数是衡量群体间遗传变异程度的可靠参数。群体间亲缘关系与其遗传距离和遗传相似系数有直接关系，当群体间亲缘关系越近时，则遗传距离越近，遗传相似系数就越大[24]。当遗传相似系数大于0.5时，此时群体间的亲缘关系为一级亲缘关系[25]。由于相关的微卫星是纯合体，且部分含有相同的片段长度，可能会得到高出理论值的遗传相似系数[26]。研究发现，沅江和汉水的群体间的遗传距离最近(0.641)，遗传相似度最高(0.525)，达到一级的亲缘关系；而嘉陵江和赣江群体之间的遗传距离最远(2.140)，遗传相似度最低(0.073)，亲缘关系最远。说明这种亲缘关系可能与群体的地理位置分布有关。

Structure软件是在取样个体的遗传构造的基础上对所在群体遗传结果进行模拟分析，其具有不受取样数量影响的特点，是群体结构遗传分析的理想工具[27-28]。本试验对4个地理群体进行结构遗传分析，结果符合UPGMA树的聚类统计，嘉陵江群体和沅江群体聚为一类，说明2个群体之间的遗传结构相似，从结构分析图中可以看出，嘉陵江群体与沅江群体存在着一定程度的基因交换，这可能与长江上游中游两个流域存在着一定的亲鱼或苗种互相供给与交流有关。赣江群体单独为一支，可能是由于赣江与长江下游湖泊相连，之前长江下游的湖泊与长江相通，现在都变为季节通江或不通江，这一过程(加上其他因素)使赣江群体与长江其他流域的瓦氏群体的基因交流较少。

3.3 遗传分化指数的影响

遗传分化指数是表征群体间的遗传分化尺度。当遗传分化指数<0.05时，说明群体间的遗传分化较弱；当0.05<遗传分化指数<0.15时，群体属于中等程度的遗传分化；当0.15<遗传分化指数<0.25时，则群体间存在较大的遗传分化；当遗传分化指数>0.25时，说明群体间分化极大[21]。本试验中4个群体的遗传分化指数为0.1613～0.4020，群体之间属于较大程度的遗传分化，其中嘉陵江群体与汉水群体之间的遗传分化水平最高，遗传分化指数为0.4020，两者间的分化程度极大(遗传分化指数>0.25)。同时分子方差分析结果表明，遗传变异大部分来源于内部个体之间，来自于群体之间的变异占31.04%。

综上所述，利用微卫星标记研究表明，长江流域的4个瓦氏黄颡鱼群体间存在一定的遗传分化，每个群体内遗传变异较大，且遗传多样性均较丰富，可作为家系选育的基础群体。郭金峰等[29]利用微卫星标记技术研究了3个山东境内黄颡鱼群体的遗传多样性及亲缘关系，并计算了遗传相似性指数和遗传分化程度，以及对构建的UPGMA树的分析，结果表明，3个黄颡鱼群体多态信息含量整体水平较高，遗传多样性较为丰富。吴勤超等[30]采用磁珠富集法筛选出10个黄颡鱼微卫星标记，并对长江中上游流域3个野生黄颡鱼群体遗传结构进行了微卫星分析，结果也很清晰地显示出3个群体具有很高的遗传多样性水平。以上研究结果表明，微卫星技术在鉴定大样本物种的种间差异性和种内多样性上具有极大的优势，结合本次试验的结果，为长江流域黄颡鱼属的遗传多样性研究提供了有价值的参考资料。本试验显示，嘉陵江瓦氏黄颡鱼群体较其他3个群体遗传多样性最低，其原因可能是本群体野生资源量少而导致瓶颈效应，遗传背景的单一等，导致多样性的水平下降[31]。也可能是受核质作用的影响[32]。在今后的育种工作中，可以利用不同群体不同个体间的遗传距离及聚类图来辅助进行繁殖配组，指导建立家系或群体选育[33]，通过计算不同个体间的遗传距离，使群体建立亲缘关系较远的繁育群组，最大限度地避免近亲交配，同时也保持群体多样性，这对于提高该鱼遗传育种潜力、缩短育种年限和加快新品种的选育具有十分重要的意义[34]。