日本沼虾多态性标记筛选及群体遗传结构分析

赵 燕，陈红菊，孔维祎，季相山，王 慧

( 1.山东农业大学，山东省动物生物工程与疾病防治重点实验室，山东 泰安 271018； 2.中国农业大学(烟台)海洋学院，山东 烟台 264000 )

日本沼虾(Macrobrachiumnipponense)，俗称青虾、河虾，在我国南北方均有分布，是我国重要的淡水经济养殖虾类[1]。近几十年来，日本沼虾养殖特别是中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)与日本沼虾的混养发展迅速，日本沼虾养殖产量及产值越来越高[2]。但与海水虾类相比，关于日本沼虾种质资源评价、良种选育等研究的较少[3]。近年来，微卫星(SSR)标记凭借其多态性高、共显性、重复性强等优点，受到遗传学研究者的重视，正被迅速用于遗传连锁图谱的建立、种质评价、亲子鉴定等研究[4-6]。但分离、鉴定微卫星标记往往耗费较大的人力物力[7]。表达序列标签(EST)是通过大规模cDNA随机测序产生的，它是开发遗传标记SSR的潜在资源，随着高通量测序技术的迅速发展，利用高通量测序获得的表达序列标签数据开发EST-SSR标记经济、高效，而且EST-SSR标记直接位于基因内部或基因上下游两端，利用EST-SSR标记更容易找到与经济性状相关联的标记[8]。并且，基于全自动DNA遗传分析仪的SSR荧光标记检测技术，用FAM、Hex、VIC和NED等荧光染料标记引物，利用ABI3730X Genetic Analyzer进行毛细管电泳，能精确分析扩增产物的片段长度，比传统方法更有优势。

国内外对日本沼虾群体遗传多样性的研究，通常采用线粒体16S rRNA序列片段变异[9]、线粒体COⅠ序列[10-11]、RAPD[12-13]、AFLP[14]等方法。随着日本沼虾SSR标记的大量开发[3,15-17]，近几年利用SSR标记分析日本沼虾群体遗传多样性或遗传结构的研究逐渐增多[18-23]，但大多是对某一水域的日本沼虾遗传结构进行分析，尚未见南、北方不同水域日本沼虾遗传结构的比较研究。

笔者首先筛选12个多态性的EST-SSR标记，接着选取了南、北方较具代表性的4个日本沼虾地理群体：太湖群体、长江下游群体、微山湖群体和东平湖群体，利用本实验室已开发的多态性微卫星标记进行荧光SSR分析，比较南、北方日本沼虾群体遗传多样性和遗传结构的差异，旨在为日本沼虾种质资源评价及良种选育工作等提供基础性资料。

1 材料与方法

1.1 样品采集与DNA抽提

用于多态性EST-SSR标记筛选的22尾日本沼虾取自东平湖的野生群体。用于群体遗传结构分析的日本沼虾分别为采自无锡淡水渔业研究中心附近太湖水域的太湖群体，采自东平湖的东平湖群体，采自微山湖的微山湖群体，采自崇明岛附近长江下游水域的长江下游群体，每个群体各采集22尾(表1)。基因组DNA抽提采用苯酚—氯仿法。

表1 各群体日本沼虾采样量与采样点

1.2 多态性EST-SSR标记筛选

基于前期研究的转录组数据(美国国立生物技术信息中心登录号：SRX1364905)[17]，依据3个标准(微卫星序列两端的侧翼序列长度大于100 bp、两碱基重复数大于9、三碱基重复数大于7)对测序结果进一步查找，将符合条件的片段，利用Primer Premier 5.0软件进行引物设计，并送上海生工合成。合成好的引物以取自东平湖的22尾日本沼虾为样本进行PCR扩增，PCR反应程序如下：94 ℃预变性5 min；94 ℃，30 s，各引物退火温度下退火30 s，72 ℃，1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。PCR产物用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，并将具有多态性的SSR标记序列提交到美国国立生物技术信息中心。

1.3 荧光标记SSR

从已经开发的日本沼虾多态性微卫星引物中挑选8对多态性水平较高的(A28、A73、D7、B93、B13、B44、B29、Z337)设计荧光微卫星引物(表2)，交由华大基因合成。利用提取的4个群体各22尾日本沼虾的基因组DNA为模板和合成的荧光引物进行PCR扩增。PCR扩增体系为25 μL，包括：1×PCR buffer，1.5 mmol/L Mg2+，200 μmol/L dNTP，200 μmol/L上下游引物，0.25 U Taq酶，100 ng模板，灭菌去离子水补齐。PCR反应程序如下：94 ℃预变性5 min；94 ℃，30 s，各引物退火温度下退火30 s，72 ℃，1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min。4 ℃保存。PCR产物送北京华大基因，用ABI3730X Genetic Analyzer进行毛细管电泳和基因型分型。

表2 荧光SSR引物

1.4 数据分析

利用POPGENE Version 1.31进行群体遗传分析，计算微卫星等位基因数、等位基因频率、各群体间的遗传距离、观测杂合度、期望杂合度及哈代—温伯格平衡检验的概率值[24]。利用PIC_CALC 0.6计算多态信息含量[25]。用MICRO-CHECKER Version 2.2.3软件分析各位点的无效等位基因频率[26]。各位点间的多重比较经过Bonferroni校正[27]。利用MEGA 6.0构建UPGMA进化树、进行Bootstrap检验。利用ARLEQUIN 3.1计算群体内固定系数及群体间分化指数，并进行分子方差分析[28]。

2 结果与分析

2.1 多态性EST-SSR标记筛选

日本沼虾转录组测序共得到153 673 014 bp的数据，其中有8014个序列包含简单重复序列；进一步筛选后共选择出546个cDNA序列，Blast比对后发现与已开发的微卫星标记没有重复，从中设计了60对引物，并将其在22尾东平湖日本沼虾个体中进行了PCR扩增及电泳检测。结果显示，60对引物中有33对能扩增出稳定、清晰的条带，其中12对呈现出良好的多态性(表3)。这12个多态性微卫星标记的等位基因数3～7，观测杂合度0.1724～0.9630，期望杂合度0.1942～0.8462(表4)，BONFERRONI校正之后(校正的P=0.05)有8个偏离哈代—温伯格平衡。12个多态性微卫星标记中10个多态性较高(多态信息含量>0.4)。这些多态性的微卫星标记能用于群体遗传多样性分析和遗传连锁图谱构建等工作。

表3 日本沼虾EST-SSR多态性标记筛选结果

表4 日本沼虾EST-SSR多态性标记等位基因数及杂合度

2.2 群体的遗传多样性

荧光SSR基因分型结果显示，长江下游群体的平均等位基因数最多(13.5000)，其次是微山湖群体(12.2500)，太湖群体最低(11.8750)。微山湖群体的平均期望杂合度和观测杂合度均最高(0.8403、0.8350)，东平湖的次之(0.8353、0.7854)，长江下游群体的最低(0.7145、0.7909)(表5)。由此可见，北方2个群体(微山湖与东平湖群体)的遗传多样性高于南方2个群体(太湖群体与长江下游群体)。

表5 群体的遗传多样性

8个微卫星标记在4个日本沼虾群体中共检测到166个等位基因，各位点等位基因数和有效等位基因数分别为5～29和2.10～17.76，平均每个微卫星位点有20.75个等位基因，B44的等位基因数(29个)和有效等位基因数(17.76)均为最多；各位点的观测杂合度为0.5862～0.8851，期望杂合度为0.5279～0.9492，显示8个位点均具有较高的杂合性；除A73位点(0.4589)外，其他位点多态信息含量均大于0.8(0.8557～0.9409)，具有高度多态性(表6)。

表6 微卫星位点的等位基因数、杂合度及多态信息含量

2.3 群体的遗传分化

分子方差分析显示，4个日本沼虾群体中89.29%的变异来源于个体内，6.52%的变异来源于群体内个体间，4.18%的变异来源于群体间(表7)，显著性检验分析显示，这4个日本沼虾群体遗传分化极显著(P<0.01)。

表7 日本沼虾群体分子方差分析

4个日本沼虾群体两两间遗传分化指数为0.0031～0.0739，其中东平湖群体与长江下游群体、微山湖群体与长江下游群体的0.05<遗传分化指数<0.15，属中等分化程度；其他群体间的遗传分化指数值均低于0.05，分化程度较弱，其中微山湖与东平湖群体分化程度最弱，为0.0031(表8)。

表8 日本沼虾群体遗传分化指数

2.4 群体的遗传变异分析

利用POPGENE软件计算分析，结果显示，分化引起的偏离值为-0.1159～0.2775，平均值为0.1055；群体内固定系数为-0.1926～0.2383，平均值为0.0626，显示群体内存在一定程度的近交。群体间的遗传分化指数为0.0219～0.0982，平均值为0.0457(小于0.05)，说明群体分化时间较短，分化较弱。各位点的基因流均较大，为2.2946～11.1835，平均为5.2172，表明各群体间的基因流较高(表9)。

表9 各位点的F值和基因流

2.5 群体间遗传距离

根据等位基因频率计算了4个日本沼虾群体的遗传相似度和Nei氏遗传距离(DA)，结果显示，各群体间遗传相似度为0.6312～0.9162，遗传距离为0.0158～0.3844，北方的微山湖和东平湖2个群体的遗传相似度最大(0.9162)，遗传距离最小(0.0158)；长江下游群体和微山湖群体的遗传相似度最小(0.6312)，遗传距离最大(0.3844)(表10)。

表10 4个日本沼虾群体间遗传相似度(对角线上)和Nei氏遗传距离(对角线下)

基于遗传距离的UPGMA聚类结果显示，东平湖和微山湖群体先聚为一支，再与太湖群体聚为一支，最后与长江下游群体聚类(图1)，这种聚类关系与实际的地理分布吻合，也反映了各日本沼虾群体的生物地理进化关系。

图1 基于遗传距离的UPGMA聚类树

3 讨 论

3.1 EST-SSR的筛选与应用

与Ⅱ型微卫星标记相比，Ⅰ型的EST-SSR与已知的基因紧密连锁或就位于基因内部。2004年，Serapion等[29]首次在斑点叉尾(Ictaluruspunctatus)中开发和鉴定了EST-SSR，随后表达序列标签的数据应用于许多水产动物的EST-SSR开发，如美洲牡蛎(Crassostreavirginica)[30]、拟穴青蟹(Scyllaparamamosain)[31]、泥蚶(Tegillarcagranosa)[32]、栉江珧(Atrinapectinata)[33]、脊尾白虾(Exopalaemoncarinicauda)[34]等。笔者设计了60对引物，33对能扩增出稳定、清晰的条带，55%的比例与中华绒螯蟹(51%)[35]和蜘蛛蟹(Majabrachydactyla)(64%)[36]的结果相似。由于EST-SSR与基因紧密关联或位于基因内部，其更易受到选择压力的作用而表现出较高的保守性[31]，并且与Ⅱ型微卫星标记相比具有更低的多态性。在泥蚶中[37]，6个Ⅱ型微卫星标记，每个位点平均扩增出5.4个等位基因，平均多态信息含量为0.546，而34个EST-SSR标记中，平均每个位点扩增出3.59个等位基因，平均多态信息含量为0.4，EST-SSR标记的多态性明显低于Ⅱ型微卫星标记。在条斑星鲽(Veraspermoseri)[38]中，Ⅱ型微卫星标记，平均每个位点扩增出3.1个等位基因，平均观测杂合度为0.61，而EST-SSR标记，平均每个位点扩增出2.3个等位基因，平均观测杂合度为0.42。在拟穴青蟹[31]中，Ⅰ型微卫星标记的平均等位基因数、平均观测杂合度和多态信息含量分别为5.9、0.67和0.58，显著低于Ⅱ型微卫星标记的(6.8、0.76和0.67)[39]。在试验中，12个日本沼虾EST-SSR，平均每个位点扩增出4.41个等位基因数，平均观测杂合度为0.6792，显著低于用Ⅱ型微卫星标记分析的结果(太湖群体观测杂合度0.7399、东平湖群体观测杂合度0.7854、微山湖群体观测杂合度0.8350、长江下游群体观测杂合度0.7145)。

近年来，EST-SSR标记正逐渐应用于经济性状的关联分析和定位等研究，李鸥等[40]利用70个鲤鱼(Cyprinuscarpio)EST-SSR对鲤鱼全同胞家系92尾个体的基因组DNA进行扫描，采用拟回交策略对符合1∶1分离的标记与鲤鱼饲料转化率性状进行单标记回归分析，发现6个标记与饲料转化率性状相关，其中2个达到极显著水平。Li等[41]研究发现，黄颡鱼(Pelteobagrusfulvidraco)GH基因3′UTR区有2个SSR，其中有些单倍型与黄颡鱼体宽、头长等有显著的正相关。胡吟胜等[42]用5对EST-SSR引物对18个琼枝(Betaphycusgelatinae)个体的基因组进行扩增，结果显示，野生群体和养殖群体的多态性比例分别为74.29%和70.00%；野生群体之间的平均遗传距离为0.46，养殖群体之间的平均遗传距离为0.22。综上，本试验首次开发了12个多态性的日本沼虾EST-SSR标记，这些标记可应用于日本沼虾遗传连锁图谱构建、关联分析等研究。

3.2 日本沼虾4个地理群体的遗传多样性

本试验使用的8对微卫星引物，除A73位点(多态信息含量为0.4589)属于中度多态性位点外，其他位点的多态信息含量(0.8557～0.9409)均大于0.5，属于高度多态性位点[25]，能满足分析日本沼虾各群体遗传多样性和遗传结构的需要。本试验结果显示，4个日本沼虾群体的遗传多样性均处于较高水平，尤其是北方的2个群体，微山湖群体的平均期望杂合度和观测杂合度均最高(0.8403、0.8350)，东平湖次之(0.8353、0.7854)，长江下游群体的最低(0.7909、0.7145)。冯建彬等[18]分析了洪泽湖9个日本沼虾野生群体的遗传多样性，平均期望杂合度为0.6982～0.8044，平均观测杂合度为0.3042～0.4604；张敏莹等[19]的研究结果表明，洮湖日本沼虾群体的平均期望杂合度为0.7766，平均观测杂合度为0.7425；冯建彬等[20]对太湖的吴江、滨湖、宜兴和吴兴4个日本沼虾群体的遗传多样性分析显示，4个群体平均期望杂合度为0.8886～0.9149，平均观测杂合度为0.7500～0.8222。本试验结果高于江苏洪泽湖[18]、洮湖[19]等群体，但略低于太湖群体[20]，说明太湖日本沼虾群体具有较高遗传多样性，其中宜兴和滨湖群体遗传多样性高于吴江群体。这可能与取样地点、分析方法及选用的微卫星标记多态性差异有关。总体来说，北方日本沼虾群体的遗传多样性处于较高的水平，可以进行深入的良种选育等工作。

3.3 日本沼虾4个地理群体的遗传距离

Wright等[43]认为，0<遗传分化指数<0.05，表示分化程度较弱，0.05<遗传分化指数<0.15，表示分化程度中等，0.15<遗传分化指数<0.25，表示分化程度较大。本试验中4个日本沼虾群体间遗传分化指数为0.0031～0.0739，其中东平湖与长江下游群体、微山湖与长江下游群体的遗传分化指数介于0.05～0.15，属中等分化程度；其他群体间的遗传分化指数均小于0.05，分化程度较弱，这与马克异等[1,20-22]的研究结果相似，说明日本沼虾群体分化程度不强，但地理比较远的群体间遗传分化还是较大，如东平湖群体与长江下游群体(崇明岛附近)间、微山湖群体与长江下游群体(崇明岛附近)间。通过遗传分析检测到具有中等分化程度的群体可以作为选择育种的基础群，也可以进行群体间的杂交育种。

基因流指一个种群的基因转移至另外一个种群，它通常是个体迁移的结果，代表基因之间的交流程度。本试验结果显示，各座位的基因流，介于2.2946～11.1835，平均5.2172，根据Govindajaru[44]确定的标准，当基因流>1,表明各个群体在各位点间存在着一定的基因流动。

遗传距离可表示物种间或群体间的基因组差异水平。本试验中4个日本沼虾群体的遗传距离，微山湖和东平湖群体的遗传距离最小，为0.0158；长江下游群体与东平湖、微山湖群体的遗传距离较大，分别为0.3449、0.3844，而与太湖群体遗传距离较小，为0.1836。这与各群体间群体遗传分化指数相一致，微山湖与东平湖群体分化程度最弱，为0.0031，长江下游群体与东平湖、微山湖群体属中等分化程度。基于遗传距离的UPGMA聚类结果也显示了这种一致性，地理位置最近的北方2个群体(东平湖和微山湖群体)首先聚类，然后与太湖群体聚为一支，最后与长江下游群体聚类，这与实际的地理间隔相符，随着地理距离的增大，亲缘关系渐远，反映出一定的生物地理进化关系。