青海西宁地区猪肉食品中致病性沙门菌耐药性分析

赵维章，张正英

(青海省动物疫病预防控制中心，青海 西宁 810000)

据世界卫生组织(World Health Organization,WHO)统计，食源性病原菌中的大肠杆菌和沙门菌成为畜产品污染中常见的食源性致病菌，以沙门菌对人的危害较大[1]。沙门菌呈世界性流行，被沙门菌污染的肉、蛋、奶等动物源性食品成为感染人类的主要途径，主要引起人们腹泻、呕吐等症状，严重者还会引起败血症，甚至导致死亡，严重危害公共卫生安全[2]。沙门菌在自然界中具有广泛的宿主，各种食物包括零售动物肉类食品、鸡蛋、水果及蔬菜，尤其是禽、猪肉产品，被认为是沙门菌传播和暴发的载体[3]。相关研究表明，猪是沙门菌的主要宿主，养猪场、屠宰场和市场是猪源沙门菌发生污染和传播的主要场所，人们食用被污染的猪肉或猪肉制品后引发沙门菌病[4]。因此，加强猪肉生产、零售链中沙门菌的监测和防控具有重要的意义。

本试验从青海西宁地区屠宰场、零售店、超市等采集猪肉食品样品246份进行沙门菌分离鉴定，采用人工感染小鼠试验、Kauffmann-White法、K-B药敏纸片法分别检测沙门菌的致病性、血清型及耐药性，分析该地区猪肉食品中沙门菌污染情况与耐药情况，为进一步防控提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 病料来源 2019年6-12月，从青海西宁地区屠宰场、零售店、超市等采集猪肉食品样品246份进行沙门菌分离鉴定。

1.2 主要试剂 缓冲蛋白胨水(BPW)、四硫磺酸钠煌绿增菌液(TTB)、木糖赖氨酸(XLT-4)琼脂，均购自广东环凯微生物科技有限公司；木糖赖氨酸脱氧胆盐(XLD)琼脂、沙门菌显色培养基，均购自青岛海博生物技术有限公司；2×TaqMaster Mix、DL-2 000 DNA Marker，均购自北京康为世纪生物科技有限公司；ID32E肠道菌生化鉴定试纸条、药敏纸片，均购自北京天坛药物生物技术开发公司；沙门菌属诊断血清，购自宁波天润生物药业有限公司；细菌生化鉴定系统由法国生物梅里埃公司生产；PCR仪由德国Eppendorf公司生产。

1.3 实验动物 25 g左右健康昆明系小鼠236只，购自西宁市实验动物有限公司。

1.4 方法

1.4.1 细菌分离与培养 将采集的样品分装BPW，220 r/min 37 ℃培养8 h后，取100 μL 接种于TTB中，220 r/min 37 ℃培养8 h，划线接种于XLT-4 平板，经 37 ℃培养12 h，挑取疑似沙门菌的黑色单菌落于沙门菌显色培养基，37 ℃培养12 h，挑取沙门菌显色培养基的紫色单菌落接种于普通营养肉汤中进行纯化培养，取纯化培养的细菌进行革兰染色，显微镜观察。

1.4.2 细菌生化鉴定 按说明书对纯化培养的分离菌株调整为0.5个麦氏浊度，接种到ID32E肠道菌生化鉴定试纸条中培养12～24 h，用细菌生化鉴定系统进行生化特性鉴定。

1.4.3 细菌PCR鉴定 按参考文献[5]设计沙门菌的特异性鉴定引物invA，上游为：5′-GAAATTATCGCCACGTTCGGGCA-3′，下游为：5′-TCATCGCACCGTCAAAGGA-3′。引物片段大小为249 bp，由北京擎科生物科技有限公司合成。采用水煮法制备分离菌株的DNA模板，对分离菌株进行PCR鉴定，将PCR产物送北京擎科生物科技有限公司合成进行测序，测序结果与GenBank中登录的参考株进行同源性比对。

1.4.4 细菌致病性试验检测 分离菌株用菌落计数法进行计数，调整浓度为1×108CFU/mL。每1株分离菌株用灌胃方式攻毒2只小鼠，剂量为0.25 mL(1×108CFU/mL)，对照组接种等量无菌的营养肉汤，攻毒的12 h后，观察7 d，记录小鼠的发病及死亡情况，进行细菌学鉴定。

1.4.5 细菌血清型分型检测 按参考文献[6]采用Kauffmann-White法对分离的沙门菌进行血清鉴定。

1.4.6 药敏试验 按照美国临床检验标准化委员会(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)推荐的标准K-B纸片法进行试验操作、药物试验和结果判断。

2 结果

2.1 细菌分离与培养 疑似沙门菌分离菌株在XLT-4 平板上长出圆形、大小一致、湿润的、黑色的单菌落；在沙门菌显色培养基上长出单个、大小一致、边缘整齐的紫色菌落。革兰染色镜检可见单个或成对存在、无芽孢、无荚膜、两端钝圆的阴性短杆菌。经统计246份样品中分离到了117株疑似沙门菌的菌株。

2.2 细菌生化试验 分离菌株用ID32E肠道菌生化鉴定试纸条和细菌生化鉴定系统进行鉴定，117株被鉴定为沙门菌，评定结果合格率为99.7%～99.9%。其生化鉴定结果与报道的沙门菌的生化特性一致。

2.3 细菌PCR鉴定 用设计的沙门菌invA基因引物，对疑似菌株进行 PCR 鉴定，1%琼脂糖凝胶电泳检测，117株疑似菌株均扩增出大约为249 bp目的条带，与预期的相符(见图1)，分离菌株的测序结果与GenBank中登录的13株沙门菌参考株的同源性在98.9%～99.9%。说明分离的117株菌株为沙门菌。

图1 分离菌株的PCR鉴定结果Fig.1 Results of isolated strains PCR identificationM:DL-2 000分子量标准；1:空白对照；2～12:分离菌株M:DL-2 000 Marker;1:Blank control;2～12:Isolated strains

2.4 动物致病性试验 攻毒组小鼠在攻毒后2～6 d 出现不同程度的死亡，主要呈现精神沉郁、采食量减少、腹泻，个别未见临床症状出现死亡，直到试验结束，从死亡的小鼠体内分离到沙门菌，对照组的小鼠健康存活。据统计56株沙门菌能引起小鼠的死亡，为致病性沙门菌。

2.5 血清型检测 对分离的56株致病性沙门菌进行血清型鉴定。由表1可知，56株致病性沙门菌分别属于10种不同的血清型，其中以猪霍乱沙门菌、鼠伤寒沙门菌和肠炎沙门菌3种血清为主要流行致病血清型，分别占致病菌株的26.8%、21.4%和19.6%。

表1 致病性沙门菌血清型检测Table 1 Serotype test results of pathogenic Salmonella

2.6 耐药性分析 由表2可知，56株致病性沙门菌对氨苄西林、新霉素、阿莫西林、磺胺间甲氧嘧啶、庆大霉素5种药物耐药比较严重，耐药率在85.7%～96.4%；对环丙沙星、红霉素、林可霉素、强力霉素4种药物的耐药率在50%～75.0%；对其他药物耐药率在12.5%～35.7%。说明分离的56株致病性沙门菌耐药性严重。

表2 药敏试验结果Table 2 Drug sensitivity test results

3 讨论

沙门菌具有广泛的动物宿主，可以引起多种动物和人感染，是临床中一种重要的人兽共患病致病菌，其感染人和动物的途径广泛，沙门菌感染人会导致急性胃肠炎、败血症等疾病，严重者可以导致死亡，沙门菌可以引起动物的败血症、胃肠炎及其他组织和局部炎症，并且会导致怀孕母畜流产[7]。相关研究表明，沙门菌主要存在于肉类食品中，人们食用被沙门菌污染的食物后也可能导致急性食物中毒，甚至引起死亡，因此，沙门菌菌株的出现和传播对医学、兽医学和公共卫生十分重要[8]。沙门菌污染肉类产品引起食物中毒已经成为人们关注的热点。

沙门菌可以感染多种宿主动物，其抗原复杂且血清型众多，沙门菌主要包括菌体 O 抗原、鞭毛H抗原和荚膜Vi抗原，目前世界发现了2 600多种沙门菌的血清型，我国发现的沙门菌血清型就有292种，其中有20种左右特定的沙门菌血清型易引起人兽患病，如鸡白痢沙门菌、鼠伤寒沙门菌、伤寒沙门菌、猪霍乱沙门菌、肠炎沙门菌等[2-4]。研究表明，对人和动物危害较大的沙门菌的血清型为鼠伤寒沙门菌、肠炎沙门菌以及猪霍乱沙门菌等[5]。本试验结果表明，从青海西宁地区采集的246份猪肉食品样品中分离到了56株致病性沙门菌，属于10种血清型，以猪霍乱沙门菌、鼠伤寒沙门菌和肠炎沙门菌3种血清为主要流行致病血清型，分别占致病菌株的26.8%、21.4%和19.6%。说明该省多地区猪肉食品中分离的致病性沙门菌血清型复杂。金宣晨[4]报道了猪产业链中分离的沙门菌以德尔卑沙门菌(35.1%)和鼠伤寒沙门菌(31.0%)为优势血清型。李鹏[6]报道了酒泉市市售冷冻羊肉分离的沙门菌以鼠伤寒型和德比型所占比例最高。张强等[9]报道了从杨凌及周边地区零售分割鸡肉中分离的34株沙门菌中共检出10种血清型，其中科瓦利斯沙门菌最为流行。与本试验均有一定差异性，可能与地区及分离不同种类的动物肉类有关。

沙门菌易产生耐药性，沙门菌耐药性可以通过抗生素耐药质粒、整合子和转座子携带的可转移元件作为抗生素耐药性传递的供体，可以通过抗生素耐药基因元件一起转移，将编码耐药基因转移到不同宿主上，促进具毒性和耐药性的细菌分离株的出现，通过食物链在人和动物中传播[10]。因此，沙门菌耐药性对人和动物危害较大。本试验结果表明，分离的56株致病性沙门菌分离株对氨苄西林、新霉素、阿莫西林等9种药物耐药率在50%以上，对其他药物耐药率在12.5%～35.7%。表明青海西宁地区猪肉食品中分离沙门菌耐药性严重，可能与该地区生猪养殖过程中不合理的使用抗菌药物有关，应该引起重视。