蝉花ＳＬＧＹ－２对斜纹夜蛾生长发育及体内保护酶活性的影响

张胜兰 刘健锋 邹晓 杨茂发 商胜华

摘 要：为探究蝉花Isaria cicadae SLGY-2对斜纹夜蛾生长发育和体内3种保护酶活性的影响。采用不同浓度的蝉花SLGY-2对斜纹夜蛾2龄幼虫侵染处理，观察后期生长发育;并对不同时间段处理后斜纹夜蛾体内酶活性进行测定。结果表明：不同浓度孢子悬浮液处理后，斜纹夜蛾幼虫发育历期显著延长，化蛹率和羽化率显著降低，同时产卵量也显著降低;对蛹重和卵的孵化率无显著影响。孢子悬液浓度在1×108个/mL时，虫体内SOD活性在处理16h时达到最高，为75.98U/mg，酶的比活力为同期对照组的2.49倍，CAT活性为88.46U/mg;处理24h时，POD活性为7.56U/mg，3种酶活性的值大于浓度为1×107个/mL条件下的处理值，且与同期对照处理结果差异显著。结果表明：斜纹夜蛾在抵御蝉花SLGY-2侵染过程时，虫体内3种保护酶均出了应激反应，且随着菌株孢子浓度增加，酶活性逐渐上升，但最终表现为下降。

关键词：斜纹夜蛾;棒束孢;生长发育;保护酶活性

中图分类号：S433.4文献标识码：A

文章编号：1008-0457（2020）04-0030-07 国际DOI编码：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2020.04.004

Abstract：In order to investigate the effect of Isaria cicadae SLGY-2 on the development of Spodoptera litura and the activities of three protective enzymes.Different concentrations of I.cicadae SLGY-2 were used to infect the 2nd instar larvae of S.litura， and the growth and development in the later period were observed; and the enzyme activity in S.litura was determined after treatment at different time periods. The results showed that the development period of S.litura larvae was significantly prolonged the pupation rate and the emergence rate were significantly reduced， and the egg production was also significantly reduced.There was no significant effect on the pupal weight and the hatchability of eggs.When the spore suspension was 1×108 per milimeter，the SOD activity in the worms reached the highest at 16 h，75.98 U/mg.The specific activity of the enzyme was 2.49 times that of the control group during the same period，and the CAT activity was 88.46 U/mg.POD activity was 7.56 U/mg when treated for 24 h， and the activities of the three enzymes were all greater than the  first two concentrations，and the results were significantly different from the control treatments of the same period. During protection against the infestation of I.cicadae SLGY-2， S.litura responded to the three protective enzymes in the insect body， and the enzyme activity gradually increased with the increase of the spore concentration of the strain， but eventually showed a decline .

Keywords：Spodoptera litura; Isaria; growth and development; protective enzyme activity

斜紋夜蛾Spodoptera litura属鳞翅目夜蛾科，是一种杂食性、暴食性、迁飞性的重要农业害虫，寄主植物多达100余种[1]，在较短时间内会给农作物造成重大的经济损失[2-3]。斜纹夜蛾具有世代重叠、繁殖速度快、繁殖数量大等特点，对大多化学杀虫剂都产生了抗药性[4-6]。

棒束孢Isaria具有寄主多、分布广、防效好、易培养等特点，能够侵染自然界中多种害虫，对害虫的种群和数量具有较好的控制作用[7]，备受国内外学者关注[8-13]。HODGE等[14]发现，被玫烟色棒束孢Isaria fumosorosea侵染致死的棉铃虫Helicoverpa armigera制成的粉剂，能够杀死棉铃虫蛹、金龟子幼虫以及斜纹夜蛾幼虫。梁宗琦等[15]发现棒束孢菌对茶树害虫有一定致病力。泽桑梓等[16]报道粉棒束孢Isaria farinosa对松小蠹Tomicus spp.防治效果较好。粉棒束孢对菜螟Hellula undalis也有较好的防治效果，致病率为58.4%～90%[17]。

在昆虫正常生理生化代谢过程中，体内的诸多酶起着重要作用[18]。超氧化物歧化酶SOD（superoxide dismutase）、过氧化物酶POD（peroxidase）、过氧化氢酶CAT（catalase）是昆虫体内的抗氧化保护酶，3者能互相互补协调一致[19-20]，与体内抵御外界病原菌的侵害密切相关[21-25]。唐维媛等研究发现斜纹夜蛾感染莱氏野村菌Nomuraea rileyi后，其体内抗氧化酶活性变化很大，且其变化趋势与幼虫所处的发育阶段密切相关[26]。菜青虫Pieris rapae在抵抗金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae侵染过程中，SOD、POD、CAT都发生作用[27]。刘烁安等[23]发现感染蜡蚧轮枝菌Verticiuium lecanii的螺旋粉虱Aleurodicus disperses russell在不同时间其体内保护酶和解毒酶的活性会产生一定程度的变化，判断体内的防御机制与SOD、CAT、GST和EST活性有相关性。

昆虫病原真菌的发生与昆虫所处的发育阶段密切相关[28-30]。为有效发挥昆虫病原真菌的效果，除了提高昆虫病原真菌的侵染力，还可从昆虫自身抵御外界袭击的防御机制来研究[17]。前人研究了棒束孢对不同寄主昆虫的影响，探讨了昆虫病原真菌对昆虫保护酶活性的关系，但未见棒束孢对斜纹夜蛾感染和体内保护酶活性变化的研究。本文从蝉花SLGY-2菌株不同浓度孢子悬浮液侵染斜纹夜蛾，以及不同时间段感染2龄幼虫后，体内SOD，POD和CAT保护酶系统的变化趋势入手，探究不同浓度的真菌孢子悬浮液对斜纹夜蛾的影响和体内保护酶的变化规律，为提高昆虫病原真菌对害虫的生物防治效果提供重要参考。

1 材料与方法

菌株：蝉花SLGY-2由贵州大学生命科学学院真菌资源研究所（GZAC）提供，用PDA斜面培养基于冰箱（4℃）保存。

供试昆虫：斜纹夜蛾采自贵州省遵义市烟草公司乐山科技园区的烟田，于贵州大学昆虫研究所人工气候室（温度（27±1）℃，湿度（75±5）%，L：D=14：10）用自己配制人工饲料饲养3代以上，取2龄幼虫作为试验试虫。

仪器：冷冻离心机、冷冻研磨仪、酶标仪、酶活性测定试剂盒购买于苏州科铭生物技术有限公司。

1.1 不同浓度处理对斜纹夜蛾幼虫生长发育的影响

使用0.05%吐温-80将蝉花SLGY-2孢子悬浮液稀释成1×106个/mL、1×107个/mL、1×108个/mL共3个浓度。将采集的虫源连续饲养3代至化蛹，羽化后将成虫按1：1雌雄配对，于250mL杯子中饲养，同时用脱脂棉球蘸取10%蜂蜜水供给营养，用0.095mm网孔纱布和橡皮圈封口[6]。选取生长发育状况一致的2龄幼虫，用3个浓度孢子悬浮液进行浸渍处理，以0.05%吐温-80处理为对照，每个处理30头，重复3次，于养虫盒内单头饲养[26]。并于另外养虫盒饲养4个处理的试虫，待后期成虫配对备用。置于人工气候箱中饲养，每24h更换饲料并及时清除残留饲料和粪便，每天观察记录斜纹夜蛾生长发育情况，头壳蜕皮情况，龄期。若有试虫死亡，记录死亡数，用小毛笔轻轻触摸虫体，以幼虫无力且不能正常爬行作为死亡记录。

1.2 不同浓度处理对斜纹夜蛾繁殖的影响

待幼虫长至老熟时，在饲养盒底部铺一层3cm的泥土供其化蛹，化蛹后3d，称量蛹重。记录化蛹率，观察羽化情况和雌雄比并记录。羽化后，将成虫按1：1雌雄配对，配对10对成虫，于250mL杯子内饲养，脱脂棉球蘸取10%蜂蜜水供给营养，用0.095mm网孔纱布和橡皮圈封口，每个处理重复3次。产卵后用小毛笔（笔毛长1.5cm、笔头宽0.4cm、笔总长20.9cm）轻轻刷杯壁收集卵块，计数每天产卵量。取同一天的卵块于培养皿内（直径9cm，高2cm），无菌培养皿底部垫上滤纸保湿，每个处理100粒卵，每个处理重复5次，记录观察孵化情况。

1.3 保护酶活性测定

粗提液制备：分别取处理8、16、24、32、40、48、56、64和72h后的斜纹夜蛾幼虫，以0.05mol/LpH7.0的磷酸缓冲液（PBS）冲洗，转入装有研磨珠的研磨管中[26]，加入提取液（50mmolTris-HClpH7.4含2mmol醋酸镁，1mmol EDTA和10%甘油）250μL，置于冷冻研磨仪（50HZ、60s、4℃）研磨5次。取出放于冷冻离心机（1000r/min、4℃）离心10min。移液枪移取100μL待测液测定过氧化物酶POD[31-32];移取50μL上清液后，加入350μL提取液混匀，用于测定超氧化物歧化酶SOD和过氧化氢酶CAT[31]。

1.4 数据处理

数据采用SPSS17.0軟件和Excel2019对试验数据进行统计，试验结果以平均值±标准差表示，同时进行方差和Duncan多重比较差异显著性分析，计算各种酶对斜纹夜蛾的酶活性并作图。

2 结果与分析

2.1 不同浓度处理对斜纹夜蛾生长发育的影响

不同浓度处理斜纹夜蛾后，观察其生长发育情况（表1），随着病原真菌悬浮液处理浓度的升高，死亡率呈逐渐升高趋势，且在菌液的各个处理组中，随着龄期增加，其死亡率也显著升高。其中，在6龄时108个/mL处理组中，死亡率达66.99±351%，各处理之间差异显著。以108个/mL处理后，3龄和5龄幼虫发育历期与对照组无显著差异，而2龄、4龄、6龄幼虫发育历期与对照组相比

显著延长。并且，随着龄期增加，幼虫的生长发育历期逐渐延长，且浓度越高，幼虫的发育历期越长。随着处理浓度升高，幼虫的发育历期呈逐渐延长趋势。处理后幼虫发育历期比对照延长了113～250d。蛹历期处理组比对照相对较长，雄蛹历期大于雌蛹历期。各个处理后对蛹重影响无显著差异。化蛹率和羽化率都随着处理浓度的升高而降低，108个/mL时，化蛹率相比对照降低了3737%，羽化率相比对照降低了37.38%，差异显著，各浓度处理对雌性比无显著差异。

2.2 不同浓度处理对斜纹夜蛾繁殖的影响

各处理组中的单雌总产卵量显著低于对照组的单雌总产卵量，但3个浓度处理组之间无显著差异;蝉花SLGY-2处理对卵的孵化率和雌虫产卵前期无显著影响，但处理组的雌虫产卵期较对照组显著延长（表2）。另外，从不同浓度处理后对斜纹夜蛾成虫每日产卵量统计结果可知（图1），斜纹夜蛾成虫产卵高峰期出现在雌虫羽化后第3d;处理组与对照组相比，在1～3d时，雌虫单日产卵量均被显著抑制，且随着浓度升高，雌虫单日产卵量呈现出降低趋势，4～5d时各个处理之间产卵量差异不显著。

2.3 斜纹夜蛾体内超氧化物歧化酶（SOD）酶活性的变化

经蝉花SLGY-2处理后斜纹夜蛾体内SOD活性变化结果显示（图2），在浓度为106个/mL和107个/mL孢子悬浮液处理下，SOD活性呈现出先上升后下降的趋势，且分别在56h和48h时达到峰值（56.69U/mg和66.99U/mg），為对照的2.41和2.53倍;浓度为108个/mL孢子悬浮液处理16h时，其SOD活性达到最大值（75.98U/mg），酶的比活力为同期对照组的2.49倍。另外，在处理相同的时间内，蝉花SLGY-2处理后能够显著诱导斜纹夜蛾体内SOD的活性，在处理8～32h时，SOD的活性随着菌液浓度的升高而增强，并且在72h时恢复到正常水平。

2.4 斜纹夜蛾体内过氧化物酶（POD）酶活性的变化

经蝉花SLGY-2处理后斜纹夜蛾体内POD活性变化如图3所示。3个浓度孢子悬浮液处理斜纹夜蛾均在24h时，POD活性最大，其中108个/mL孢子悬浮液处理组活性最高，为7.56U/mg，是对照的2.67倍，在32～40h时急剧下降，且低于对照组的酶活性水平。3个浓度处理后POD活性均呈现先升高后下降趋势。

2.5 斜纹夜蛾体内过氧化氢酶（CAT）酶活性的变化

经蝉花SLGY-2处理后斜纹夜蛾体内CAT活性变化如图4所示，处理组较对照组的CAT活性在接菌后变化较大。106个/mL孢子悬浮液处理斜纹夜蛾8～16h时，CAT活性上升，后缓慢下降，56h后CAT活性低于对照组。107个/mL孢子悬浮液处理组，在24h时，CAT活性值最大，之后逐渐下降，于56h后低于对照组。108个/mL孢子悬浮液处理斜纹夜蛾16h时，CAT活性达到峰值（88.46U/mg），为对照的2.07倍，之后于64h后降低到对照组的酶活性水平之下。同时，在处理8h和16h时，CAT活性随着孢子悬浮液浓度的增加而增加，且显著高于对照组。

3 结论与讨论

昆虫感染昆虫病原真菌后，体内的组织成分、生理生化、营养结构和繁殖力等都会发生变化[16]。本研究以不同浓度昆虫病原真菌蝉花SLGY-2处理斜纹夜蛾后，对其生长发育、蛹和繁殖都有影响。研究发现该菌对斜纹夜蛾不同龄期幼虫具有影响，这与陆永跃等[33]、袁盛勇等[34]采用莱氏野村菌侵染棉铃虫、甜菜夜蛾S.exigua及斜纹夜蛾后，对其各龄幼虫的生长发育均有影响，但不同虫龄幼虫的敏感性存在显著差异结果相似。张仙红[35]发现菜青虫被玫烟色拟青霉Paecilomyces fumosoroseus侵染后，2×108个/mL处理3龄菜青虫的化蛹率为35.83%，其中64.17%的蛹表现出畸形不能正常化蛹，羽化率为31.7%，与本研究孢子浓度越高，化蛹率和羽化率越低结果相似。同样，白僵菌Beauveria bassiana侵染马尾松毛虫Dendrolimus punctatus后，其幼虫体重和取食量增加，但蛹重、化蛹率和羽化率均显著降低，与本研究孢子浓度越高，化蛹率和羽化率越低结果相似[36]。刘藩[37]用杨树接种外生菌根真菌Paxillus involutus的叶片饲喂杨扇舟蛾Clostera anachoreta幼虫发现，其2～3龄幼虫的体重显著降低，幼虫生长发育历期延长，4～5龄幼虫、蛹期、蛹重、成虫寿命、雌虫生殖力无差异变化，本研究发现菌株感染后幼虫生长发育历期也有延长。根据慢生长-高死亡率假说的理论，发育历期延长的昆虫更容易被天敌捕食杀害[37]。本研究发现蝉花SLGY-2处理后能延缓斜纹夜蛾的生长发育，将更有利于天敌对斜纹夜蛾的捕食或寄生作用，提高幼虫的死亡率。与此同时，蝉花SLGY-2处理还能够显著降低雌虫的产卵量，将进一步降低下一代种群数量。

昆虫体内正常活性氧平衡系统会因遭受逆境条件等的胁迫而被破坏，虫体也会因自由基浓度升高而遭受影响[38-39]。昆虫生长发育过程中，为抵御外界病原菌的侵染，体内的保护酶起着重要作用[40-41]。张仙红等[42]研究玫烟色拟青霉侵染菜青虫3～4龄幼虫后，发现该菌对宿主的侵染和虫体内的保护酶相关。本研究中发现，被蝉花SLGY-2侵染后，斜纹夜蛾虫体内的SOD、POD和CAT的酶活性均表现为先升高后降低趋势，这与姬国红等[43]研究夜蛾斯氏线虫对菜青虫几种保护酶活力的影响时，3种酶活性也呈现先升高后降低趋势的试验结果相似。王宏民等[44]利用玫烟色棒束孢对小菜蛾Plutella xylostella进行侵染试验，结果表明小菜蛾3龄幼虫在感染前期，体内酶活性均迅速升高，感染后期酶活性降低。张奎花等[21]研究菜青虫被异小杆线虫Heterorhabditis megidis侵染后SOD、POD、CAT活性在接种后都显著上升后下降，均与本文研究结果相似。这些结果表明，斜纹夜蛾在抵御蝉花SLGY-2侵染过程时，虫体内3种保护酶均作出了应激反应，且随着菌株孢子浓度增加，酶活性逐渐上升，但最终表现为下降。

本试验中蝉花SLGY-2孢子悬浮液低浓度处理时斜纹夜蛾幼虫体内的SOD活性变化相对较慢，在40～56h时活性才升高至峰值，而高浓度处理时在16h活性最高，斜纹夜蛾感染后期SOD值下降，这可能是由于蝉花SLGY-2在虫体内繁殖，SOD合成受影响，防卫能力降低所导致的。被不同浓度菌液侵染后，斜纹夜蛾体内启动免疫系统合成POD，来抵御体内可能产生的某些有毒性的氧化物，以维持正常的生理平衡。试验发现POD的酶活性均低于另外两种酶，有待于进一步探究POD的酶活性在鳞翅目昆虫体内的存在情况。3种酶分别于不同时间点到达峰值，说明3种酶之间有相互协调作用。该试验进一步证明了蝉棒束孢菌在控制斜纹夜蛾害虫方面的研究价值和应用潜力，为更好地研究蝉棒束孢菌对斜纹夜蛾的作用机制及虫体内保护酶的作用方式提供一些理论依据，但仍还需从多角度进行深入探究以发挥其对害虫绿色防控研究作出贡献。

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