活血荣络方对Aβ25-35诱导的星形胶质细胞阿尔兹海默病损伤的抑制作用及其机制研究

陈瑶，宋洋，杨仁义，杨小钰，胡华，刘利娟，周德生*

(1.湖南中医药大学第一附属医院神经内科，湖南 长沙 410007；2.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208)

阿尔兹海默病(Alzheimer Disease,AD)是一种以记忆和认知功能下降、行为及人格异常改变为主要表现的中枢神经系统退行性疾病[1]。我国伴随老龄化加重，2012年AD患者数约为700万，给家庭和社会带来一定负担。AD发病机制复杂，β淀粉样蛋白(Amyloid protein,Aβ)沉积是AD发病的重要机制，Aβ是淀粉样前体蛋白(Amyloid precursor protein，APP)的水解产物，具有神经毒性，与细胞内Ca2+超载、炎症反应、神经元凋亡发生联系[2-3]。Aβ的大量沉积引发突触功能障碍[4-5]，从而导致痴呆。因此APP的表达与AD发病密切相关，并涉及诸多环节。

AD属中医“痴呆”“善忘”等范畴。与肾、心、脾、肝功能密切，多属本虚标实之证。老年中多以肾虚致瘀血发病，阴虚血瘀阻滞脑络，使神灵失养，出现神经功能症状，善忘、失算、齿脱、发白、腰膝酸软、乏力、转身遗忘、神情呆滞[6]。中医药充分发挥双向调节的作用，在治疗AD方面优势显著，活血荣络方作为湖南中医药大学第一附属医院神经内科协定方，临床运用已久，疗效确切。本研究以多奈哌齐和分泌型卷曲蛋白(the Secreted Frizzled related protein,sFRP)为对照，观察不同剂量活血荣络方对Aβ25-35损伤星形胶质细胞的保护作用及对Aβ及APP的表达水平的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康雄性清洁级SD大鼠120只，2～3个月，体质量200～250 g(含药血清240 mL)； 24 h内的新生SD大鼠60只，体质量5～6 g(原代胶质细胞培养)，随机分配，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，由湖南中医药大学实验动物中心提供。

1.2 实验药物

活血荣络方(成分：鸡血藤:石楠藤:玄参:生地黄:黄精:乳香:没药:川芎=6:6:3:3:3:2:2:2比例组成)。经过提取、浓缩、冷却等步骤后得到浸膏，于4 ℃保存。根据人与大鼠体表面积换算法，用蒸馏水按1 mL/100 g配比稀释浸膏，稀释后1 mL含生药1.1 g的药液进行灌胃。

盐酸多奈哌齐(陕西方舟制药有限公司；国药准字：H20030583；规格：5 mg/片)，粉碎后溶解于蒸馏水，配成5.8 mg/kg溶液，于4 ℃保存。

Aβ25-35(北京博奥森生物技术有限公司)，按照Aβ25-35说明书配制，于4 ℃保存。

1.3 主要试剂及仪器

DMEM高糖培养基(GIBCO)，胎牛血清(Hyclone)，DAB试剂盒(北京中杉金桥)，1:250胰蛋白酶(AMRESCO)左旋多聚赖氨酸、DMSO、MTT、RNA酶A、FITC标记的羊抗兔抗体、PI(Sigma公司)，一次性细胞培养瓶、板(Corning公司)，倒置显微镜 (德国Leica)，CO2培养箱(德国WTB150)。

1.4 方法

1.4.1 AD靶点蛋白PPI网络构建

通过GeneCards(https://www.genecards.org/)数据库，以“Alzheimer Disease”为检索词，收集AD的作用靶点，以Score值≥15为限定条件进行筛选。采用string数据库及Cytoscape软件Network analyzer功能构建靶点PPI网络。根据Degree值对靶点进行筛选分析。

1.4.2 疾病靶点基因本体论(GO)富集分析

通过DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)数据库，将疾病靶点进行GO富集分析。共同靶点以“OFFICIAL GENE SYMBOL”格式导入，设定“Background”为“Homo sapiens”，设定P<0.05，分别导出细胞组分(Cellular Component, CC)、分子功能(Molecular Function, MF)，生物过程(Biological Process, BP)，对P值取负对数，得出“-lgP”，将数据导入Origin，绘制heatmap进行富集分析。

1.4.3 含药血清制备

SD大鼠120只随机分成空白组、sFRP组、多奈哌齐组、0.5倍活血荣络方组、1倍活血荣络方组、2倍活血荣络方组，每组20只，药物组按体表面积换算给药，空白组以蒸馏水灌胃，1 d/次，连续给药7 d。末次给药1 h后，在无菌条件下经腹主动脉采血，分离血清、灭活补体、微孔滤膜过滤除菌、-20 ℃保存。

1.4.4 星形胶质细胞培养及Aβ25-35星形胶质细胞AD模型制备

采用新生SD大鼠大脑皮质提取的原代星形胶质细胞，并进行体外培养与纯度鉴定，经鉴定后进行干预。采用40 μmol/L的Aβ25-35干预鉴定后的星形胶质细胞24 h，制备Aβ25-35星形胶质细胞(Aβ25-35AS)AD模型。

1.4.5 实验分组与给药

分别将Aβ25-35AS铺板，密度为(2.5～3)×104/孔，接种于96孔板，随机分成空白组、sFRP组、多奈哌齐组、0.5倍活血荣络方组、1倍活血荣络方组、2倍活血荣络方组，采用DMEM清洗2～3次，药物组予以含药血清，sFRP予以sFRP，空白组予以空白血清。分别取生长对数期细胞加刺激处理12 h、24 h、48 h、72 h。

1.4.6 MTT检测细胞活性

各组相应刺激处理12 h、24 h、48 h、72 h后，加入浓度为40 μmol/L的Aβ，24 h后各组均加入MTT 20 μL(5 mg/mL，溶于0.01 mol/L PBS)，培养4 h后吸取上清液，加入DMSO100 μL并振荡10 min，然后在检测波长570 nm的TECAN多功能酶标仪条件下测各孔吸光度(OD值)。

1.4.7 Aβ及APP表达的检测

取细胞上清液并分离细胞，采用免疫组化法检测各组Aβ、APP蛋白的定位定量表达。按照免疫组化试剂盒进行染色，每组选取6 张切片，并随机观察5个视野，选取视野内所有阳性细胞，根据阳性细胞面积/总面积计算面密度，以评估Aβ、APP蛋白的定量表达。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 疾病靶点预测以及构建PPI网络图

通过GeneCards(https://www.genecards.org/)数据库，以“AD”为检索词，收集AD作用靶点，以Score值≥15为限定条件进行筛选，得到35个靶点；采用string数据库及Cytoscape软件Network analyzer功能构建靶点PPI网络(图1)。按照“Degree”分析，颜色越深，Combine score值越大，其中APOE、APP最为显著，结果表明可能通过多个作用靶点致AD。因此这些靶点为治疗提供新思路。为我们运用网络药理学方法对活血荣络方治疗AD进一步探索提供前期研究基础。

图1 AD靶点PPI网络

2.2 疾病靶点GO富集分析

利用DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)数据库，将35个靶点进行GO富集分析，对P值取负对数，得出“-lgP”值，-lgP值越大，富集程度越大，各取BP、CC、MF前15个Gene ID，通过基因靶点PPI网络建立，取具有相对较强作用联系的15个靶点APOE、APP、PSEN1、PSEN2、SNCA、ACHE、TNF、BDNF、MAPT、NGF、ADAM10、MAOB、CASP3、STAT3、GSK3B进行分析。运用Origin软件将“-lgP”值值作为依据对每个基因进行赋值，绘制heatmap，得到图2。GO富集结果显示说明APOE、APP、PSEN1、PSEN2、SNCA在多部位、通过多途径调控AD的发生发展，有望成为重要治疗靶点，为治疗AD提供新的理论依据。

注：横坐标为GO(MF; CC;BP)；纵坐标为共同靶点图2 GO富集分析

2.3 MTT检测各组对Aβ25-35AS的作用

MTT结果各组12 h、24 h、48 h、72 hOD值显示，随着时间延长OD值越大，2倍活血荣络方组72 h高于12 h，且具有统计学意义(P<0.05)，其余各组OD值随时间增加，但无明显差异(P>0.05)。各组OD值比较结果：药物组OD值均高于空白组，即AS细胞活性均高于空白组(P<0.05)；2倍活血荣络方组具有最高的细胞活性，sFRP组具有最低细胞活性(P<0.05)，且具有统计学意义。OD值详见图3。

图3 各组对Aβ25-35AS模型OD值的影响

2.4 各组Aβ25-35损伤星形胶质细胞Aβ及APP表达比较

Aβ及APP主要表达在细胞浆上，免疫组化染色呈棕黄色，各给药组Aβ及APP的表达均低于空白组(P<0.05)。2倍活血荣络方组Aβ及APP表达均低于其它给药组(P<0.01)。1倍活血荣络方组与多奈哌齐组Aβ及APP表达下降程度差异比较P>0.05。并且，各组Aβ及APP表达随时间延长有逐渐减少趋势，但2倍活血荣络方组减少最明显。见图4、表1。

表1 各组Aβ25-35损伤星形胶质细胞Aβ及APP的表达

图4 各组各时间点Aβ及APP的表达

3 讨论

AD属中医“痴呆”“善忘”等范畴，病性总属本虚标实，病位在脑，与肾、心、脾、肝等密切相关。肾主藏精，精充髓海，髓以养荣，则脑功能正常，AD者肾精不足，髓海亏虚也。“髓海不足，则脑转耳鸣，胫酸眩冒，目无所见，懈怠安卧”(《灵枢·海论》)。“痴呆者，因阳气衰，则心力渐退、忘失前后、兴居怠惰”(《千金翼方》)，此中多指肾阳衰弱，则发为痴呆，且记忆力下降。荣气者，气、血、津、液、精等精微物质总称也，荣气源于先天之精，赖水谷精微和自然清气充养，化生于五脏，以荣养温润全外显之象源于精气之荣华。髓不生，则荣气异常，引起荣气虚滞。荣气虚滞又无力充养脑脉，填补肾精，继而神经症状日益严重，人至四十者多“阴气自半，肾阴不足，起居衰而多忘”(《素问·阴阳应象大论》)，仲景提出“喜忘者必有蓄血”的理论 (《伤寒论·辨阳明病脉证并治》)，王清任进一步阐述“瘀血者，令人善忘”(《医林改错》)，综上,肾阴不足则多健忘，多瘀血，可知阴虚血瘀是痴呆发病的关键病机，故生命盛极而衰乃生命之道，而荣气之虚与荣气之滞为其推动原因。荣气虚滞彼此消长平衡，无修复契机者，虚更虚，滞更滞，进而加速AD进程[7-8]。基于“阴虚血瘀—荣气虚滞”理论立方的活血荣络方具有滋阴生津、活血通络的功效，在AD临床治疗中取得疗效较好。

AD是老年人的常见病，多发病，近年研究表明β淀粉样蛋白(β-amyloid protein,Aβ)是AD至关重要的致病因素[9]，AD主要病理变化是来源于β-淀粉样前体蛋白(β-amyloid precursor protein,APP)的沉积在胞外沉积形成老年斑。APP作为一种跨膜蛋白，能被APP切割酶、β-分泌酶、γ-分泌酶(presenilin-1,PSEN1)切割形成Aβ，APP/Aβ稳态失衡能使自噬体中Aβ沉积[10]，是各种原因诱发AD的共同通道，可导致神经元退化和死亡。大量流行病学、病理学、免疫学、生物化学和分子生物学研究表明AD患者脑内持续存在着激活的神经胶质细胞与慢性炎症反应，可能是其它病理特征形成和发展的诱发因素。因此有学者认为AD可能是一种慢性的中枢神经系统炎症反应[11]，其炎症主要是由于Aβ介导的星形胶质细胞和小胶质细胞活化所触发[12-13]，Aβ能诱导炎性细胞因子(如IL-1β、TNF-α、IL-6、血管内皮粘附分子等)在体外培养的星形胶质细胞和小胶质细胞中表达[14]，越来越多的证据表明Aβ可通过Toll样受体、糖基化终末产物受体、转化生长因子β1和NOD样受体等激活神经胶质细胞，激活的神经胶质细胞能分泌出毒性细胞因子和化学因子，从而增加APP产生、促进Aβ裂解、聚集并沉积形成老年斑。炎症因子能介导局部炎症反应，导致脑内炎性产物水平持续升高，对神经突触等结构产生毒副作用，进而导致突触传递功能障碍等病理损害的发生。水平异常升高的炎性产物在AD病理损伤的不同阶段具有不同的作用，并贯穿于AD发生和发展的整个过程。Aβ导致的局部炎症反应在AD的形成和发展过程中发挥着重要作用。

本研究结合生物信息学，运用中医药多途径、多靶点、双向调节的优势，基于GeneCards数据库，筛选AD共35个靶点，结合String及Cytoscape软件算法分析对35个功能靶点进行蛋白互作PPI分析，其中APOE、APP最为显著，见图5,前期研究结果[15-16]证实活血荣络方能上调Wnt5α、Fz5、Ca MKII、AchE、ChAT等靶点水平,在AD治疗中发挥作用。从微观角度推测活血荣络方可能通过调节APP的表达在治疗AD中发挥作用。同时利用DAVID数据库，将35个靶点进行GO富集分析，GO富集结果显示说明APOE、APP、PSEN1、PSEN2、SNCA在多部位、通过多途径调控AD的发生发展，其有望成为重要治疗靶点，为治疗AD提供新的理论依据。

为进一步验证生物信息学预测结果，本研究采用Aβ25-35损伤星形胶质细胞模型，利用MTT及免疫组化法进行验证。MTT结果得出2倍活血荣络方组72 h星形胶质细胞活性高于各组，免疫组化结果得出2倍活血荣络方组Aβ及APP表达均低于其它给药组，并且Aβ及APP表达随时间延长有逐渐减少趋势，但2倍活血荣络方组减少最明显，表明活血荣络方具有较强的剂量与时间依赖性，且呈正相关，得出活血荣络方可通过调控APP及Aβ蛋白表达从而抑制Aβ25-35诱导的星形胶质细胞损伤，发挥神经保护作用，并且高剂量、时间越长，作用越强。Aβ能诱导星形胶质细胞中炎性细胞因子表达[14]，炎症因子介导的慢性炎症反应可导致脑内炎性产物水平持续升高，对突触产生毒性作用，导致突触传递功能障碍等病理损害的发生，本研究采用中枢性乙酰胆碱酯酶(AChE)抑制剂多奈哌齐与Wnt通路抑制剂sFRP作为对照组，结果显示活血荣络方可能通过Wnt信号通路抑制 AChE活性，改善神经突触炎症毒性，进而在AD疾病治疗中发挥作用。

图5 共同靶点富集hsa05010通路情况

综上所述，本研究为AD的临床治疗提供了理论和实验依据，提出基于“阴虚血瘀—荣气虚滞”理论立方的活血荣络方可能通过多靶点、多成分、多通路发挥治疗AD疾病的作用，并进一步实验验证其治疗作用可能通过Wnt信号通路抑制APP、Aβ蛋白的表达，抑制 AChE活性，从而改善神经突触炎症毒性有关。