玉竹黄酮提取纯化及体外抗氧化研究

李素红，江明珠，姜晓坤,2，李天娇,2，李凤林,2，程碧君,2*

（1.吉林农业科技学院食品工程学院，吉林吉林 132101；2.吉林省酿造技术科技创新中心，吉林吉林 132101）

玉竹又称尾声、铃铛菜、竹根七、田草根等，为百合科黄精属多年生草本植物，广泛分布于我国北方、东部和中部，其中吉林、陕西等省均有大面积人工种植。新鲜的玉竹根部是浅黄色或浅白色，干燥后为棕黄色或深棕色。玉竹是一种药食同源植物，干燥的根茎是我国常用的中药材之一，具有润燥、养阴、除烦祛暑、止渴等作用。玉竹中的活性物质主要有多糖、黄酮、皂苷、生物碱等，现代药理学研究发现，玉竹及其提取物有抗衰老、抗氧化、降血脂、降血糖、改善心血管疾病等多种功效[1-2]。因此近年来玉竹研究成为热点。

黄酮类化合物是某一类具有相同或相似化学结构和活性物质的天然化合物的统称，自然界中分布广泛，在蔬菜、水果的根茎叶中均有存在[3]。黄酮类化合物也是一类天然色素，在植物中有一定的含量[4]。黄酮类化合物具有保护心血管、抗炎以及保肝的功效，还具有抗氧化性，能够抑制细胞的退化、衰老[5]。因此，对黄酮类化合物的研究成为国内外天然药物开发和研究的热点，但目前玉竹黄酮提取及纯化方面的文献报道很少。本试验以玉竹为研究对象，采用超声波辅助法提取黄酮，经过单因素和正交试验，得出最佳提取工艺；在此基础上，采用D-101 大孔树脂对玉竹粗黄酮进行纯化，主要以黄酮吸附速率和解吸速率作为纯化的指标；采用清除自由基试验来判定纯化后玉竹黄酮的抗氧化性，为玉竹黄酮的大规模开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 原料与试剂

三年生圆叶玉竹，由吉林农业科技学院食品工程学院基地提供；亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、乙醇、盐酸、水杨酸、VC、FeSO4由食品工程学院理化实验室提供；98%芦丁标准品（153-18-4）购自图林实验耗材（南昌）；DPPH、Tris-HCl 缓冲溶液购自沃瑞达斯实验试剂耗材（南京）；大孔树脂购自凯威化工专供店（杭州）；邻苯三酚，购自安吉达实验科技公司（青岛）。

1.1.2 仪器与设备

F-008S 超声波清洗器，苏州迈弘电器有限公司；V-T5/PC 紫外可见分光光度计，屹谱仪器制造有限公司；BO-150P2 粉碎机，永康市铂欧五金制品有限公司；FA1004 电子分析天平，宁波市江东欧亿检测仪器有限公司；TG18-WS 离心机，长沙湘锐离心机有限公司。

1.2 方法

1.2.1 玉竹黄酮的提取及测定

（1）玉竹黄酮的提取

新鲜玉竹切成薄片、放入60 ℃烘箱，烘干至恒质量，取出用粉碎机粉碎，过60 目筛备用。称取玉竹粉末，分别放置在不同的锥形瓶中，选用不同的乙醇浓度、料液比和超声时间，在超声波清洗器中提取。提取完成后，置于离心机中离心，澄清后取上清液。

（2）标准曲线的绘制

在50 mL 容量瓶加入10 mg 芦丁标准品，再加入50%乙醇至刻度线，将芦丁对照品溶液的浓度配置为0.2 mg/mL[6]。取6 个50 mL 容量瓶，标号为A～F，A 号容量瓶做空白对照，其他依次加入芦丁溶液2、4、6、8、10 mL，每个容量瓶中加入0.4 mL NaNO2（5%）溶液，混匀，放在实验台上静置6 min 后，加入0.4 mL Al(NO3)3（10%）溶液，混匀，继续静置6 min，在每个容量瓶中加入4 mL NaOH（4%）溶液，并用50%乙醇定容，混匀，继续放置15 min，在波长512 nm 处测吸光度，制作标准曲线[7]。

（3）玉竹黄酮总含量的测定

玉竹黄酮质量及得率的计算公式见式（1）（2）。

式中，c-提取液黄酮的浓度，mol/L；V1-提取液的总体积，mL；V2-制备供试液溶液定容体积，mL；V3-量取用于制备供试液溶液体积，mL；m0-总黄酮质量，mg；m1-玉竹粉的质量，g。

（4）单因素试验

称5.0 g 玉竹粉末，放置在锥形瓶中，分别设计不同试验因素：乙醇浓度（30%、40%、50%、60%、70%），液料比（5:1、10:1、15:1、20:1、25:1，mL/g），超声时间（10、20、30、40、50 min），超声功率（40、60、80、100、120 W），分析各因素对玉竹黄酮提取率的影响，在此基础上，采用正交试验优化提取工艺。

（5）正交试验

根据单因素得出最佳结果，进行四因素三水平的正交试验；根据玉竹黄酮的提取率确定最佳提取条件。正交试验设计见表1。

表1 超声法提取玉竹黄酮正交试验设计Table 1 Orthogonal design of ultrasonic extraction of flavonoids from Polygonatum odoratum

1.2.2 玉竹黄酮的纯化

（1）树脂的预处理

根据钟方丽等[8]的纯化工艺，确定采取D-101 型大孔树脂进行纯化。将准确称量的大孔树脂加入锥形瓶中，并加入95%乙醇浸泡4 h，倒出浸泡液，再用纯净水清洗，要求洗出液澄清无混浊，且呈中性后备用。

吸附率、解析率的计算公式见式（3）（4）。

式中，c0-吸附之前的浓度，mol/L；c1-吸附之后的浓度，mol/L；c2-解析之后的浓度，mol/L。

（2）试验设计

取备用玉竹黄酮溶液，分别设计不同试验因素：吸附pH（6、7、8、9、10），吸附时间（1、2、3、4、5 h），吸附液料比（5:1、10:1、15:1、20:1、25:1，mL/g），不同乙醇用量（10、15、20、25、30 mL），对玉竹黄酮进行纯化，按上述方法测定吸光度，通过对玉竹黄酮吸附率和解析率的影响来确定最佳的纯化条件。

1.3 体外抗氧化研究

1.3.1 清除DPPH 自由基

称量7.96 mg DPPH 放在100 mL 容量瓶里，再加入50%乙醇至刻度线，配成浓度为0.2 mo1/L 的DPPH 溶液，放置在黑暗的地方保存（0～4 ℃）。向5 支干净试管中加入5 mL 事先准备好的不同浓度梯度的玉竹黄酮溶液，依次加入5 mL DPPH 溶液，混合均匀后放置在黑暗中30 min，测定吸光度为A1；另取5 支试管分别加入5 mL、50%乙醇溶液，分别向试管中加入不同浓度的玉竹黄酮溶液5 mL，混合均匀后放置在黑暗中30 min，测吸光度为A2，再拿1 支试管，放入5 mL DPPH 溶液和5 mL、50%乙醇溶液，混匀后放置在黑暗中30 min，测定吸光度为A0[9-10]。以相同浓度的VC 代替玉竹黄酮溶液进行对照试验。清除率的计算公式见式（5）。

1.3.2 清除超氧阴离子自由基

取5 支洁净试管放在25 ℃恒温水浴锅里，加入4.5 mL Tris-HCl 缓冲溶液（0.05 mol/L、pH=8.0），水浴20 min，然后加入不同浓度的玉竹溶液2 mL 及邻苯三酚1 mL（30 mmol/L），混匀，水浴8 min，再加入12 mol/L 盐酸2滴，10 min 后在320 nm 测吸光度A1；另取5 支试管按上述的方法操作，将Tris-HCl 缓冲溶液换成蒸馏水，其余的条件不变，在320 nm 测吸光度A2；再另取1 支试管将玉竹溶液换成蒸馏水，其余条件不变，测定吸光度为A0[11-12]。以相同浓度的VC 代替玉竹黄酮溶液进行对照试验，清除率的计算公式见式（6）。

1.3.3 清除羟基自由基

吸取不同浓度的玉竹溶液2 mL，分别加入5 支干净的试管，然后依次加入6 mmol/L FeSO42 mL，0.3%H2O22 mL，混匀放置10 min，加入2 mL 6 mmol/L 水杨酸，混匀后在30 ℃恒温水浴锅中静置30 min，测定吸光度为A1，另取5 支试管将H2O2换成蒸馏水，则其余条件不变，测定吸光度为A2，再另取1 支试管将玉竹溶液换成蒸馏水，则其余条件不变，测定吸光度为A0[13]。以相同浓度的VC 代替玉竹黄酮溶液进行对照试验。清除率的计算公式见式（7）。

2 结果与分析

2.1 制作标准曲线

以芦丁对照品溶液的吸光度值为纵坐标，质量浓度（mg/mL）为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程Y=0.0503X-0.038 9，R2=0.997 9。结果表明，芦丁在范围内呈良好的线性关系。

2.2 提取玉竹黄酮

2.2.1 不同浓度乙醇对玉竹黄酮提取率的影响

由图1 可以看出，玉竹中黄酮的提取率随着乙醇浓度的增加先增加后减少，当乙醇浓度为40%时，玉竹黄酮提取率最高，为0.616 2%。

2.2.2 不同液料比对玉竹黄酮提取率的影响

由图2 可知，随着液料比的增加，玉竹黄酮提取率先增加后减少，当液料比为10:1（mL/g）时，黄酮的提取率最高，为0.458 2%。

2.2.3 不同超声时间对玉竹黄酮提取率的影响

由图3 可以看出，黄酮的提取率随着超声时间的增加先升高后急剧下降。当超声时间为40 min 时，玉竹黄酮的提取率最高，为0.445 2%

2.2.4 不同超声功率对玉竹黄酮提取率的影响

由图4 可以看出，黄酮的提取率随着超声功率的增加先上升后下降，当超声功率为80 W 时，提取率最高，为0.598 3%。

2.2.5 玉竹黄酮超声波辅助提取的正交试验结果

从表2 得出，影响玉竹黄酮提取率的因素为D＞A＞B＞C，即超声功率影响最大，超声时间影响最小；提取最佳条件是A3B1C3D2，即乙醇浓度为45%，液料比为7:1（mL/g），超声时间为45 min，超声功率80 W，提取率为0.517 4%。

表2 超声法提取玉竹黄酮正交试验结果表Table 2 Orthogonal test for extraction of flavonoids from Polygonatum odoratum by ultrasonic method

2.3 玉竹黄酮的纯化试验

2.3.1 不同pH 对玉竹黄酮吸附率的影响

由图5 可以看出，吸附液中pH＜8 时，玉竹中黄酮的吸附率随着pH 的增加而持续提高；当pH＞8 时，黄酮的吸附率随pH 的增加而急剧下降。因此，综合考虑选择pH8 较佳。

2.3.2 不同吸附时间对玉竹黄酮吸附率的影响

由图6 可以看出，吸附时间为3 h 时，玉竹黄酮的吸附率随时间的增加而持续提高；当时间大于3 h 时，黄酮的吸附率随着时间的增加而急剧下降。因此，综合考虑吸附时间选择3 h。

2.3.3 不同液料比对玉竹黄酮吸附率的影响

由图7 可以看出，当液料比小于15:1（mL/g）时，玉竹中黄酮的吸附率随着吸附液料比的增加而持续提高；当吸附液料比大于15:1（mL/g）时，黄酮的吸附率随着吸附液料比的增加而急剧下降。因此，综合考虑液料比选择15:1（mL/g）。

2.3.4 不同乙醇用量对玉竹黄酮解析率的影响

由图8 可以看出，解析液中乙醇用量小于20 mL时，玉竹中黄酮的解析率随着乙醇用量的增加而持续提高；当乙醇用量大于20 mL 时，黄酮的解析率随着乙醇用量的增加而急剧下降。因此，综合考虑乙醇用量选择20 mL。

2.4 玉竹黄酮体外抗氧化试验

2.4.1 DPPH 自由基清除能力测定

由图9 可知，在玉竹黄酮的不同浓度条件下，清除率呈现良好的上升状态，并无拐点出现。与VC 相比，玉竹黄酮清除DPPH 的效果稍好。由此可知，玉竹黄酮有较强的清除DPPH 自由基的能力。

2.4.2 超氧阴离子自由基清除能力测定

由图10 可知，在玉竹黄酮的不同浓度条件下，清除率呈现良好的上升状态，并无拐点出现。与VC 相比，玉竹黄酮清除超氧阴离子的效果要好。可见，玉竹黄酮对超氧阴离子自由基有较好的清除能力。

2.4.3 羟基自由基清除能力测定

从图11 可知，在玉竹黄酮不同浓度的条件下，清除率呈现良好的上升状态，并无拐点出现。与VC 相比，玉竹黄酮VC 清除羟基自由基的效果要稍好。由此可知，玉竹黄酮溶液对羟基自由基具有较好的清除能力。

3 结论

本试验选用玉竹为原材料，使用超声波辅助法提取玉竹黄酮，试验得出最佳工艺条件为乙醇浓度45%，料液比7:1（mL/g），超声时间45 min，超声功率80 W，此条件下黄酮提取率达到0.517 4%。采取D-101 大孔树脂纯化粗玉竹黄酮溶液，最优纯化工艺为pH 8，吸附时间3 h，吸附料液比15:1（mL/g），乙醇用量20 mL。通过对玉竹黄酮抗氧化能力的测定，得出玉竹黄酮溶液具有抗氧化的能力，这为玉竹黄酮的抗氧化性试验提供了指导，为抗氧化产品的开发提供了技术依据，也为当地玉竹资源的合理开发提供了一条有效的途径。