基于青海弧菌Q67的镀锌废水土壤污染的生物毒性效应

（1.中国科学院大学资源与环境学院，北京 100049；2.沧州科技事务司法鉴定中心，河北 沧州 061000）

电镀工艺在机械工业、轻工业等行业承担着重要的角色，其中镀锌工艺在生产中应用广泛。镀锌层具有致密、沉积均匀、相对便宜的优势，该镀种在电镀行业所占比例高达45%～65%[1]。但在镀锌过程中，会产生大量含有锌、铬等物质的有毒废水[2]。镀锌企业排放的重金属废水污染土壤，也可以通过渗透到地下水和大气沉降[3]等途径威胁环境安全，导致健康问题，使污染区人群的疾病发生率和死亡率明显升高[4]。

在公益诉讼司法实践中，对生态环境损害鉴定的技术需求包含“现场采样-快速检测-筛查定性”等诸多环节，其中对于快速定性、筛查主导污染物（对毒性贡献大的污染物）技术的要求日益凸显。目前对重金属污染场地进行的鉴定主要依靠化学分析手段。当某些场地无法明确主导污染物时，仅依靠化学分析无法对污染物的环境风险作出准确评价，可能会出现化学指标达到标准但是生物指标依然显示高毒[5]，或化学指标浓度下降而毒性仍然增长的情况[6]，此时污染物形态变化复杂且难以区分。而生物毒性水平可以更直观地反映污染物在迁移、转化及降解过程中引起的毒性变化过程，体现污染物对各级生物的毒性效应，同时能够追踪污染物的代谢毒性变化，更加直接、快速、综合地反映场地污染状况。栾晓等[7]将快速检测遗传毒性的发光细菌Acinetobactersp.RecA应用于溢油污染海水样品的毒性评价，发现将发光细菌菌株加入全细胞生物传感器，可快速判定原油泄漏事故中污染海水样品的遗传毒性，并获得污染海水毒性随时间的动态变化。ZHOU等[8]利用发光细菌测试，评估农业土壤中抗生素降解前后的生态毒性并定量降解效率，为控制农业土壤污染提供了一种可选方法。HALMI等[9]利用热带发光菌株Photobacterium.sp.开发了快速发光细菌测试，并应用于马来西亚多个重金属污染地点的现场试验工作，证明该发光细菌测试可以应用于水环境中重金属的早期检测。因此，在环境损害鉴定中，将化学分析方法与生物毒性试验相结合，获取环境损害的综合信息，成为新的研究热点。本研究将构建一种针对土壤的快速生物急性毒性诊断方法，一方面基于化学检测结果对污染因子含量、来源进行分析，另一方面测定样品急性生物毒性，探究污染因子与生物毒性的相关性并解析出主导污染物，为污染土壤急性毒性鉴定提供新的思路和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 采样点分布与样品采集

场地位于某农村平房旁，该平房为小型镀锌生产厂房，面积约170m2，生产废水由一根直径为160mm的管道引入旁边洼地。目前洼地表面无明显污染迹象，初步判断管口为污染起始点，即图1中的点9。

采用网格布点采样法，对场地内倾倒点附近的疑似污染区域进行重点布点。如图1所示，现场共布设13个土壤采样点，其中远离倾倒点的点13为背景点。每个采样点采集表层土500 g，将采集的样品装入密封袋，冷藏运输至实验室中，进行风干研磨后过100目筛，待用。

图1 采样点分布示意图Fig.1 Schematic of sampling point distribution

1.2 有效态金属检测

考虑镀锌废水可能产生生物毒性的主要组分是污染场地土壤的有效态金属，因此本研究重点对有效态金属进行分析。有效态金属是指土壤中易被植物吸收的重金属部分[10]，也称为“可提取态”。

采用浸提法提取污染土壤中的污染物用于测定土壤有效态金属含量，同时制备细菌的暴露溶液：按50 mL去离子水∶10 g土壤样品混合至50 mL离心管中，超声提取15min后放入BHO-402A型恒温振荡器（上海一恒科学仪器有限公司）中振荡6 h，再超声提取15 min[11]。超声-振荡处理后静置2 h，取上清液用0.22 μm水系滤膜过滤，使用iCAPTMQ ICP-MS系统（美国Thermo Fisher Scientific公司）测定滤液中的金属含量。

用高浓度人工模拟土壤溶液（high-concentration artificial soil solution，HAS）[12]将土壤中提取的暴露溶液以100%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%、5%、1%浓度梯度稀释，共12个梯度。实验过程中，使用空白对照样品和土壤标准物质样品（GSS-5，中国计量科学研究院）进行全过程质量控制。分析所用试剂均为优级纯，实验用水均为去离子水。

1.3 基于青海弧菌Q67的发光细菌法

1.3.1 实验菌种

发光细菌法主要利用发光细菌对污染物的生物发光响应来确定污染物的生物毒性。其中淡水发光菌——青海弧菌Q67（Vibrio qinghaiensissp.-Q67）和明亮发光杆菌T3均为国内外常用的发光细菌，青海弧菌Q67具有无盐度干扰、适用pH值范围广、不改变污染物形态等特点，在环境保护、生物等领域被广泛应用[13]。

本实验采用的青海弧菌Q67购自北京滨松光子股份有限公司，培养基成分为：胰胨0.50%，酵母膏0.50%，甘油0.30%，MgCl20.32%，KBr 0.02%，CaSO40.01%，NaCl 0.40%，KCl 0.40%，pH 8.5±0.5[14]。实验时将4℃保存的青海弧菌Q67转移到新鲜斜面上，倒置放在恒温培养箱中于22℃培养24 h后，再从中挑取菌落接种于新鲜斜面培养基上，相同条件下继续培养24h获得第二代菌种。继续重复以上过程至第三代，然后将培养好的第三代菌种置于4℃冰箱中备用。使用前将培养好的菌种接种到50 mL液体培养基中，在22℃下培养12～16h。

1.3.2 菌悬液的配制

培养好的菌体以12 850×g离心10 min后收集固体部分，用配制好的HAS作为背景溶液将菌体制成菌悬液。调整菌悬液的密度，使其发光强度在6×104相对光单位（relative light unit，RLU）左右。

1.3.3 急性毒性试验

以标准的白色不透明96孔板（美国Corning公司）为载体，每排12个孔，共8排。为避免96孔板在酶标仪中的边缘效应，周围的36个孔分别加入200 μL超纯水。在第2、6、7、11列的微孔中加入100μL HAS作为空白对照组（b），在第3、4、5、8、9、10列的微孔中加入100 μL配制好的不同浓度梯度的土壤浸提液作为样品组（c），如图2所示[15]。用12道移液器移取100 μL配制好的菌悬液于b组和c组中，在Synergy H1多功能酶标仪（美国BioTek公司）中振荡20min后测定每个孔的RLU。

图2 青海弧菌Q67毒性测试中的微孔板实验设计Fig.2 Experimental design of microplates in Vibrio qinghaiensis sp.-Q67 toxicity test

以空白对照组的RLU均值（I0）和各浓度的3个平行样品的RLU均值（I）计算待测样品对发光菌发光的相对发光率[relative luminous rate，X（%）][16]和发光抑制率[luminous inhibition rate，E（%）][17]：

每块板重复检测3次以减少随机误差。

1.3.4 数据处理

数据统计处理与分析采用SPSS 24.0软件进行，绘图采用OriginPro 8.6软件（美国OriginLab公司）。

标准差由公式3得出，变异系数为标准差与平均值之比。

其中，S为样本标准差，xi为金属i的实测值，为金属的平均浓度。

瑞典科学家HAKANSON提出潜在生态风险指数法[18]，即将土壤中污染物的含量折算成生物毒性风险，用于评价受污染土壤的潜在生态风险。本研究针对重金属共存情况，通过加和方式衡量，计算方法如下：

相关性分析采用Pearson相关分析，检验水准α=0.01。

主成分分析（principal component analysis，PCA）使用SPSS 24.0软件的因子分析模块进行分析。

多元逐步回归是回归分析模型中的一种方法，能够区分解释变量（对毒性影响大的污染组分）和干扰变量（对毒性影响小或无影响的污染组分），并由大到小将解释变量逐个引入进行回归以得到对因变量（本研究中为青海弧菌Q67表征的毒性大小）贡献较大的解释变量。采用SPSS 24.0软件中的线性回归模型进行分析。

2 结 果

2.1 土壤有效态金属含量及源解析

2.1.1 土壤有效态金属含量分析及潜在生态风险评价

检测结果显示，该场地土壤中有金属18种，描述性统计结果见表1。

表1 有效态金属含量及潜在生态风险指数Tab.1 Concentration of available metals and potential ecological risk index （n=12）

Co、Cr、Se和Ni总体含量较低，该场地土壤有效态金属平均质量分数顺序为：Pb＞Fe＞Zn＞Sn＞Th＞Al＞U＞Cd＞Mn＞Bi＞V＞Li＞Cu＞As＞Ni＞Se＞Cr＞Co，66.7%的采样点金属检出率为100%，该场地存在严重污染，Zn的最高质量分数远远高于其他金属。

不同采样点间金属质量分数的标准差结果显示，金属质量分数的变化程度存在空间差异，其中Pb和Zn的空间分布差异最大，质量分数范围跨度最大，这与该场地主要污染物为镀锌废水的情况一致。

从变异系数来看，Zn、Pb、Bi 3种重金属的变异系数超过100%，存在较大差异，说明其来自人为污染的可能性较大。而其余金属的质量分数变异系数都小于1，说明各采样点这些金属含量的差异不大。

表1显示，潜在生态风险指数最高的2种重金属为Cd和Zn，尤其是Cd，质量分数相对不高但潜在生态风险指数最高，说明单一化学含量分析在评价生态风险时不够全面。不同采样点间的综合潜在生态风险指数差异较大。

2.1.2 源解析及特征污染物的变化

本研究分析了不同污染物、不同离子含量之间的相关性，结果如图3所示。Zn与Mn、Pb、Bi和Cd的相关系数分别为0.89、0.94、0.94和0.67；Pb和Cd的相关系数为0.80；Ca与SO42-、Mg的相关系数分别为0.90和0.83。这些污染物之间存在正相关性（P＜0.01）。相关性较高的污染物具有相似的来源，但有些污染物间的相关性较差，如Cu、Sn与其他污染物均无显著相关，这些污染物分别具有其独特的污染源。

图3 不同污染物含量与相对发光率的相关系数Fig.3 Correlation coefficients of different pollutants and relative luminous rate

对所检测出的污染物成分进行主成分分析，提取出5个主成分，如图4所示。

主成分1来自生产废水排放，载荷较高的组分有Mn、Zn、Pb和Bi，主成分1解释了总方差的24.4%。主成分2为土壤本身来源，其中SO42-、Mg、Ca、Li这些地壳元素的载荷较高，解释了总方差的18.8%。主成分3来自生产金属镀件碎屑，载荷较高的组分是Ni、Cu、As、Cd、Cr和V，解释了总方差的18.0%。主成分4中Cl-、Na+的载荷因子较高，代表了土壤盐分，解释了总方差的9.3%。主成分5中载荷较高的组分包括溶解有机碳（dissolved organic carbon，DOC）、Th，代表了土壤有机物来源及地壳元素，解释了总方差的8.2%。

图4 污染土壤的主成分分析Fig.4 Principal component analysis of polluted soil

2.2 镀锌废水污染土壤对发光细菌的急性毒性效应

由于每个采样点金属含量不同，所以青海弧菌Q67的急性毒性表现也不相同[20]。本研究测得每个采样点的相对发光率如图5所示，毒性分级参照文献[18]。由图可知，各点位的相对发光率与综合潜在生态风险指数呈显著负相关（Pearson系数为-0.74，P＜0.01）。

由图5～6可知，该场地中采样点9的相对发光率为26.8%，即发光抑制率接近75%，表现出明显的抑制效应，也是唯一的“高毒”级别。点9距离废水排放点最近，其水提样品呈浅黄色，表明该点污染严重。点9两侧的点7和点11的毒性表现为中毒。点1、点2、点3等的毒性效应接近，都呈现低毒。无毒性的点12呈现了明显的低剂量毒物刺激效应，相对发光率的最大值为其对照的111.0%。

图5 各个采样点的相对发光率和综合潜在生态风险指数Fig.5 Relative luminous rate and comprehensive potential ecological risk index of each sampling position

图6 该场地土壤毒性分级分布Fig.6 Graded distribution of soil toxicity at the site

2.3 镀锌废水污染土壤主导污染物

2.3.1 镀锌废水污染土壤污染因子与生物毒性相关性分析

各污染物含量与相对发光率的相关性分析结果见图3。DOC、Zn、Bi、Pb、Mn、Cd、Ni、Cu、As等与相对发光率都呈负相关，随着含量的升高，这些污染物会抑制发光细菌的发光过程，说明其对细菌有毒害作用。其中，Zn、Mn、Cd以及DOC等污染物含量与相对发光率的相关系数更高，青海弧菌Q67对Zn、Mn、Cd以及DOC等的响应高于其他污染因子。

2.3.2 主导污染物鉴别

为了进一步理清研究区土壤污染组分与青海弧菌Q67相对发光率所表征的毒性关系，对不同污染因子和相对发光抑制率进行逐步多元线性回归，以获知对毒性贡献大的污染物组分，即鉴别出主导污染物。

回归结果如表2所示。各采样点中，Zn、Al和Cu对相对抑制率水平有显著影响，其回归方程可以解释71%的发光抑制量（调整后R2为0.71），Zn对相对抑制率水平的影响更大，其次是Al，之后是Cu。由图4可知，Zn是主成分1的组成元素，主成分1可能是工厂废水的直接排放，因此发光细菌发光率降低的主要贡献来自工厂废水的排放。Al在主成分1和主成分3中都有较高的因子载荷，Cu在主成分3中是主要组成部分之一，而主成分3被认为来自工厂废水排放和金属镀件碎屑。因此，通过逐步多元回归分析，推断该场地的主导污染物主要是Zn、Al和Cu，即来自工厂废水的直接排放和金属镀件碎屑。

表2 该场地土壤中化学组分与青海弧菌Q67相对发光抑制率间的逐步多元线性回归Tab.2 Stepwise multiple linear regression between the chemical composition of soil in the study area and the relative luminous inhibition rate of Vibrio qinghaiensis sp.-Q67

3 讨 论

3.1 镀锌废水污染土壤有效态金属含量及源解析

由表1可以看出，背景点Pb质量分数高于部分采样点，Pb是交通源的特征物，所以认为背景点在一定程度上受交通源的影响较大。

提取的主成分1中，镀锌企业在生产过程中往往排放Zn、Pb等污染物。Bi最常用于替代Pb、Cd作为黄色喷漆以及与Pb、Sn组成合金[1]，在有氯离子的酸性溶液中被淋洗出来，代表了工厂生产废水排放，尤其是原料或者辅料的偷排。

主成分2中载荷较高组分来源于土壤本身。值得注意的是Fe的载荷也比较高，代表了土壤和废液污染的混合来源。

主成分3中，设备落后陈旧的镀锌生产过程中会释放Cr、Ni等重金属元素，因此，主成分3来源于工厂的生产废水排放，更多是生产过程中金属镀件的磨损碎屑释放。

主成分4中，考虑到该场地土壤团粒结构少，因此来自土壤本身的盐分[21]。

主成分5中，Th在我国土壤中的含量较高[22]，DOC来源于土壤中的有机物，例如腐殖质等。因此，主成分5可能是土壤本身的有机物及地壳元素。

3.2 镀锌废水污染土壤生态毒理效应评估与生态风险评估的相关性

青海弧菌Q67对于Zn的响应较强，在马晓妍[23]的研究中，将Zn2+作为青海弧菌Q67的标准毒性物质用于青海弧菌Q67急性毒性检测过程的优化，表明Zn2+对青海弧菌Q67有良好的响应关系；张博文等[24]的研究证明水体中所测得的Mn、Zn、Cu、As、Pb、Cd等重金属与青海弧菌Q67接触的急性毒性存在S型剂量-效应关系，Zn对这些因子的响应值较高，因此本研究的测量结果印证了以Zn为主的复合重金属污染的生物敏感性，表明本研究所建立的发光细菌法适用于含Zn的重金属污染土壤。

图5显示，相对发光率越低的点位综合潜在生态风险指数越大，青海弧菌Q67的相对发光率和潜在生态风险指数法对于重金属污染土壤的风险评价具有一致性。在这种情况下，青海弧菌Q67可以用于重金属污染土壤的生态风险评价。

3.3 不同表征方法的主导污染物鉴别

本研究结果表明，基于潜在生态风险指数鉴别风险最大的元素为Cd和Zn，其中Cd质量分数不高，但风险指数较高，这与牛计伟等[25]的研究结果一致。造成这种情况的原因是Cd的元素释放系数很高，所以在指数计算时，Cd的毒性系数是As的3倍、Pb的6倍、Zn的10倍[19]，因此Cd的生态风险远远高于其他元素。基于发光细菌法的主导污染物依次为Zn、Al和Cu，其中“Zn+Cu”体系对发光细菌的毒性具有协同作用[26]。

根据生态风险评价（ecological risk assessment，ERA）程序，对该污染场地进行风险综合性评价，包括利用生物毒性评价污染物的暴露效应和采用潜在生态风险指数评估生态风险。本研究发现，在评价的一致性上，发光细菌法与综合潜在生态风险指数呈显著相关，但在主导污染物的鉴别上秉持不同的筛选原则，即发光细菌法相较于潜在生态风险指数法，受到更多其他因素的影响，例如污染物之间的联合作用等。因此生物毒性可以更综合地反映土壤的实际生态毒性。与传统的化学方法相比，发光细菌法可更综合、快速地定量土壤的损害程度。

3.4 结论

本实验以镀锌废水污染土壤为例进行生物毒性效应研究，结果表明，该污染场地存在重金属复合污染，主要由生产废水排放、金属镀件碎屑等污染因子造成。基于化学浓度分析计算出的潜在生态风险指数和本研究所建立的发光细菌法在评价镀锌废水污染土壤的生态风险方面具有一致性，但是发光细菌法能更加快速地评价污染场地的毒性水平和生态风险，同时排查出对毒性影响最大的主导污染物（Zn、Al和Cu）。发光细菌法有望在司法鉴定实践中替代传统化学方法，对镀锌废水或其他重金属污染土壤的生物急性毒性鉴定提供新的手段和思路。