倒提壶多糖的含量测定

隆 林1 罗朝凤2 李天先1 吕 磊1 周 丽3

1.黔西南州食品药品检验检测中心，贵州 兴义 562400；2.黔西南布依族苗族自治州医院，贵州 兴义 562400；3.兴义民族师范学院，贵州 兴义 562400

倒提壶为毛茛科翠雀属植物云南翠雀花(DelphiniumyunnanenseFranch)的干燥根，又名飞燕草、小草乌、米草乌、月下参等，以根入药。我国大部分地区均有分布[1-2]。生于海拔1000～2400 m的草坡或灌木丛[3]，其味苦、平，性温热，有毒，能驱风除湿、散寒止痛、补阴敛汗，用于治疗风湿关节痛、胃寒疼痛、盗汗、跌扑损伤[4]。近年来的研究发现，多糖类化合物具有抗肿瘤、免疫调节、抗病毒、抗衰老、降血糖等多种药理活性[5]。目前倒提壶多糖的研究分析还未见报道，故本实验对其进行多糖的提取及含量测定研究，为今后科学分析倒提壶质量和药用研究方向提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器 TU-1901型紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)、日本岛津AY220电子天平(万分之一)；赛多利斯CPA225D电子天平(十万分之一)；数显恒温水浴锅(型号HH-4，金坛市中大仪器厂)。

1.2 材料 实验所用倒提壶采于贵州各地和云南，将其新鲜的根洗净，晒干，粉碎过4号筛备用。原植物标本由贵州中医药大学药学院生药实验室孙庆文教授鉴定为毛茛科植物云南翠雀花(DelphiniumyunnanenseFranch)。D-无水葡萄糖对照品(中国食品药品检定研究院，批号110833-201508，含量99.9%)，10批样品来源见表1。试剂：蒽酮、硫酸和无水乙醇均为分析纯，水为超纯水。

表1 10批倒提壶来源

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的配制 精密称取D-无水葡萄糖对照品11.14 mg，置100 mL容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品储备液。

2.2 提取条件的考察

2.2.1 不同前处理对倒提壶多糖提取的影响

2.2.1.1 索氏提取 取2号样粉末0.25 g，精密称定， 置索氏提取器中，加入80%乙醇200 mL，加热提取4 h，取出，滤纸袋及残渣挥干后置于锥形瓶中，加水100 mL，加热回流1 h，趁热抽滤，残渣用少量热水洗涤，残渣重复加热回流2次，合并滤液与洗液，浓缩放冷后转移至100 mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀，取2 mL置50 mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀，分别精密取2 mL，照2.5项下操作，依法检测。

2.2.1.2 超声提取 取2号样粉末0.25 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，用80%乙醇100 mL超声提取(50 ℃ 40KHz)0.5 h，弃其乙醇液，重复提取1次，取出，滤纸袋及残渣挥干后置于锥形瓶中，按2.2.1.1项下“加水100 mL”起操作，依法检测。结果见表2。由表2可知，前处理结果多糖含量超声提取和索氏提取相当，但索氏提取耗时过长，故选用超声提取。

表2 不同前处理对多糖提取的影响 (n=2)

2.2.2 不同提取方法对倒提壶多糖提取的影响 取2号样粉末约0.25 g，精密称定， 共6份样，80%乙醇超声提取后，滤纸袋及残渣挥干，置锥形瓶中，加入100mL水，分别按以下三种方法进行提取：

2.2.2.1 加热回流[6]加热回流1 h，趁热抽滤，残渣用热水洗涤3次，重复加热回流2次，合并滤液；

2.2.2.2 超声提取[7]超声提取(50 ℃40 KHz)1h，趁热抽滤，残渣用热水洗涤3次，重复提取2次，合并滤液；

2.2.2.3 冷浸提取[8]冷浸提取24 h，过滤，残渣用水洗涤3次，重复提取2次，合并滤液。

将滤液浓缩放冷后转移至100mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀，取2mL置50mL容量瓶中，加水至刻度，即得倒提壶多糖供试品溶液。分别精密量取供试品溶液各2 mL，照2.5项下操作，依法检测。结果见表3。由测定结果可知，三种提取方法中加热回流提取优于超声提取和冷浸法提取，故选用加热回流提取。

表3 不同提取方法对多糖测定的影响 (n=2)

2.3 供试品溶液制备 通过比较得出供试液最佳制备方法为：精密称取倒提壶粉末0.25 g于滤纸袋中，置锥形瓶中，加80%乙醇100 mL超声提取(50 ℃ 40 KHz)0.5 h，弃其乙醇液，重复提取1次，取出，滤纸袋及残渣挥干后置于锥形瓶中，加水100 mL，加热回流1 h，趁热抽滤，残渣用少量热水洗涤，重复加热回流2次，合并滤液与洗液，浓缩放冷后转移至100 mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀，取2 mL置50 mL容量瓶中，加水至刻度，即得倒提壶多糖供试品溶液。

2.4 检测波长的确定 精密量取2.1项下对照品储备液0.5 mL和2.3项下的供试品溶液2.0 mL，置于25 mL比色管中，加水至2.0 mL，分别精密加入预先用冰水冷却的蒽酮-硫酸溶液(蒽酮0.2 g加硫酸溶解至100 mL)4 mL，混匀，置沸水浴中加热10 min，冰水浴中迅速冷却，约20 min时，以相应试剂为空白，在400～700 nm范围扫描吸光度光谱。扫描结果表明：对照品溶液及供试品溶液匀在625 nm波长处有最大吸收，确定该波长为测定波长。

2.5 标准曲线的绘制 精密量取2.1项下对照品储备液0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL，分别置于25 mL比色管中，加水至2.0 mL，分别精密加入预先用冰水冷却的蒽酮-硫酸溶液(蒽酮0.2 g加硫酸溶解至100 mL)4 mL，混匀，置沸水浴中加热10 min，冰水浴中迅速冷却，约20 min时，以相应试剂为空白，照紫外-可见分光光度法在625 nm的波长处分别测定吸光度，以葡萄糖溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，并计算回归方程和相关系数。得回归方程为y=0.0565x+ 0.0046,R2=0.999，线性范围为1.8548～11.1289 μg/mL。标准葡萄糖溶液的浓度与吸光度之间的关系如图1所示。

图1 葡萄糖标准曲线

2.6 精密度试验 精密量取2.1项下对照品储备液0.3 mL，置25 mL比色管中，照2.5项下标准曲线制备项下的方法，以相应试剂为空白，在625nm下进行检测，连续测定6次。记录其吸光度值，计算RSD为0.76%，表明仪器精密度良好，符合要求。

2.7 稳定性试验 精密量取2号样多糖供试品溶液2 mL，置25 mL比色管中，照2.5项下标准曲线制备项下的方法显色，以相应试剂为空白，每隔20 min测定其吸光度，连续2 h考察其稳定性，计算RSD值为1.36%，结果表明，本法测定样品在2 h内稳定。

2.8 重现性试验 精密称取2号样粉末6份，按2.3项下制备倒提壶多糖供试品溶液，取2.0 mL按2.5项下显色并测定吸光度，计算其含量，结果6份平均含量为24.98%，其RSD为1.87%，说明该方法重现性良好。

2.9 加样回收试验 精密称取已知含量的5号样粉末6份，每份0.125 g，加80%乙醇100 mL超声提取(50 ℃ 40 KHz)0.5 h，弃其乙醇液，重复提取1次，取出，滤纸袋及残渣挥干后置于锥形瓶中，按表5中的量精密加入D-无水葡萄糖对照品，按2.3项下自“置锥形瓶中，加水100 mL，加热回流1 h”起同法操作，按2.5项下操作并测定吸光度，计算加样回收率及RSD。

表4 加样回收率试验结果 (n=6)

2.10 倒提壶多糖的含量测定 精密量取2.3项下的倒提壶多糖供试品溶液2 mL，置于25 mL比色管中，照2.5项下标准曲线制备项下的方法，自“分别精密加入预先用冰水冷却的蒽酮-硫酸溶液”起，依法测定吸光度，根据回归方程，计算倒提壶多糖的含量，结果见表5，多糖的含量范围15.56%～29.52%，平均含量为20.60%。

表5 倒提壶多糖含量测定结果 (%,n=2)

3 讨论

倒提壶中含有丰富的化学成份，如脂质、蛋白质、氨基酸、生物碱及黄酮等，为不影响多糖的测定，应先除去脂质等小分子物质，本实验采用80%乙醇来前处理。结果多糖含量超声提取和索氏提取相当，但索氏提取耗时过长，故选用超声提取。

多糖含量测定中常用的提取方法有回流提取、超声提取和冷浸等，为证明哪种方法更适合倒提壶中多糖的提取，本实验比较了回流提取、超声提取与冷浸提取。回流提取操作简单，成本低廉，超声提取操作简便、快速，冷浸耗时长，提取不完全。回流提取法多糖含量较超声提取和冷浸提取更高，故选用回流提取法。本实验以云南和贵州产的倒提壶为实验对象，对10个批次的样本中多糖的含量进行了测定，结果显示10批次倒提壶多糖含量存在差异，多糖的含量范围为15.56%～29.52%，平均含量为20.60%，其中兴仁鲁础营野生的含量最高，云南宜良人工种植的含量最低。倒提壶为多年生草本植物，所采集的样品多为野生品，种植的只有一批，样本量较少，生长环境和生长年限的不同，致其根大小不一，多糖含量的高低是否与其有关，还需做进一步研究。