HPLC-ELSD法测定诱变育种后浙贝母生物碱活性成分的研究

乌晓

(上药康德乐（浙江）医药有限公司·浙江宁波·315100)

浙贝母，为多年生草本植物，具有极高的药用价值，其属百合科属种。药用部位主要集中于地下鳞茎，由2～3枚鳞片所组成，呈元宝状或半球形状。浙贝母鳞茎药用部位具有清热解毒、化痰、止咳、开郁、散结等功效[1-3]，尤以治风热咳嗽，肺痈喉痹，疮疡肿毒为最佳，因此，具有极高的药用应用价值，在民间，应用较为广泛[4-6]。目前，浙贝母主要分布和种植于浙江南部、江苏北部和湖南等地区，其中，道地药材尤以浙江的浙贝母为最佳，其主要分布和种植于宁波樟水镇四明山麓一带。因其具有较高药用和经济价值，应用范围广泛，列为“浙八味”药材之一[7]。通过药效学和化学成分提取分离等试验结果表明，浙贝母地下部分鳞茎的主要活性物质为生物碱化合物，尤以贝母素甲和贝母素乙为主[8]，2015版《中国药典》对浙贝母质量标准测定也以贝母素甲和贝母素乙为主[9]。

但近年来，随着浙贝母传统的无性繁殖方式带来了一定的问题，主要表现在浙贝母鳞茎的繁殖率低、繁殖速度慢、药效品质的逐步退化，育种方式的过于传统，导致了浙贝母目前在种植方向出现了对环境适应能力差，容易产生病虫害，种植面积的不断扩大，但产量方面逐年减少，使得浙贝母的道地药材产区影响较大[10]。同时，科技工作者试图采用多种技术方法来解决此些问题，如克服浙贝母鳞茎部位的休眠期，采用物理降温、化学臭氧处理等方式方法来解决浙贝母的休眠期[11]。随着科技的日新月异，已有多种诱变育种处理方式已在其他农作物等种植方向取得了不断创新和突破，受到广大科技工作者所青睐，显现出良好的市场应用价值。

为提高道地药材产区浙贝母给农民所带来的经济效益，本研究通过选育目前浙贝母中品质好、产量高和适应性强的宽叶、窄叶和狭叶种球作为实验研究对象，采用60Co-γ的不同辐射剂量处理育种，后期对对不同月份的三个品种浙贝母进行采集收样，通过HPLC-ELSD法测定和比较三个品种的浙贝母贝母素甲和贝母素乙的含量高低，从而对浙贝母的新品种选育提供一定的参考和指导。

1 仪器与试剂

仪器：1260型高效液相色谱—2424型蒸发光散射检测器联用仪(HPLC-ELSD，液相色谱仪，美国安捷伦科技有限公司；蒸发光散射检测器，美国沃特斯科技有限公司；KQ-250B型超声波清洗剂，宁波新芝生物科技有限公司；6202型高速粉碎机，北京开创同和科技发展有限公司；AX2202ZH电子天平，苏州梅特勒科技有限公司。

试剂：甲醇和乙腈色谱纯流动相均为美国天地公司；丙酮、三氯甲烷和丙酮均为分析纯，购自上海国药集团化学试剂有限公司；贝母素甲和贝母素乙对照品，分别购自上海源叶生物科技有限公司和中国生物检定所。

样品：研究所选的浙贝母种子为细叶、宽叶和狭叶浙贝母品种，通过三个不同剂量的60Co-γ辐射诱变处理，辐射剂量率为22Gy/min，其诱变剂量大小分别为15Gy、50Gy和70Gy，后再经过实验室相关处理，种植于研究实验地宁波鄞州区章水镇樟村浙贝母示范基地示范圃内，后期进行1～5月份的收集采样。

2 实验方法

2.1 样品的制备

对1～5月份的细叶、狭叶和宽叶三品种浙贝母采样收集，将鳞茎洗净后采用40℃的电热鼓风干燥箱进行烘干处理，再用中药粉碎机进行粉碎，得到各月份的三个品种浙贝母药材粉末，之后精密称定各月份、品种的浙贝母药材粉末2g左右，分别置圆底烧瓶中，并做好相应记录。分别加入氨水10ml和三氯甲烷溶液40ml，后将其静止30min，后在60℃水浴进行冷凝回流提取，提取时间为1h，最后将提取液在漏斗滤纸进行过滤，得1～5月份和不同品种的浙贝母生物碱活性成分贝母素甲和贝母素乙提取液，备用待测。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取各对照品，并做好记录，其中，贝母素甲对照品：0.0097g、贝母素乙对照品：0.0089g，对照品合置于10ml容量瓶中，以色谱级的甲醇定容至10ml，对照样品溶解采用超声波溶解，再用色谱级甲醇依次稀释成贝5个浓度的溶液，其中贝母素甲为：970、485、242.5、121.25、60.63mg/L，贝母素乙：890、445、222.5、111.25、55.63mg/L的混合对照品溶液，备用待测。

2.3 色谱条件

液相色谱参数：流动相：乙腈︰水︰二乙胺﹦70︰30︰0.03；柱温箱：30℃；流速：1.0ml/min；进样量：20μL； 色谱柱： 安捷伦 （Agilent）Plus C18250mm×4.6mm 5μm；ELSD检测器参数：恒定氮气气体压力

2.0 L/min。

3 HPLC-ELSD法测定

采用HPLC-ELSD测定法，通过2.1样品的制备处理后，对诱变辐射处理后的细叶、狭叶和宽叶三个品种浙贝母药材的生物碱活性成分贝母素甲和贝母素乙含量进行分析，对照品的HPLC-ELSD分析见图1，其中：1号峰为贝母素甲，保留时间为12.8min；2号峰为贝母素乙，保留时间为16.4min。按照2.3色谱条件和ELSD检测器参数进样分析，得到相应线性回归方程，贝母素甲标准曲线：Y=1.628X+90.69（r2=0.998），贝母素乙标准曲线Y=1.723X+80.12（r2=0.999）。

图1 对照品浙贝母的HPLC-ELSD贝母素甲和贝母素乙的色谱图Fig.1 HPLC-ELSD chromatograms of Fritillaria thunbergii alkaloids peimine A and peimine B

4 结果和讨论

4.1 不同辐射强度，采收月份为1～5月浙贝母活性生物碱测定结果

对采用收集的1～5月份浙贝母三个品种：细叶、狭叶和宽叶，通过2.1样品制备方法，并采用上述的HPLC-ELSD法测定不同月份的浙贝母进行生物碱贝母素甲和贝母素乙。

其中，在不同辐射诱变剂量处理后，收集采样的浙贝母细叶品种在1～5月份，浙贝母生物碱活性成分的贝母素甲和贝母素乙含量测定结果之和具体见表1。

表1 浙贝母细叶品种生物碱贝母素甲+贝母素乙含量(mg)Fig.1 Content of alkaloids peimine a+peimine B in Fritillaria thunbergii fine leaf varieties

在不同辐射诱变剂量处理后，收集采样的浙贝母狭叶品种在1～5月份，浙贝母生物碱活性成分的贝母素甲和贝母素乙含量测定结果之和具体见表2。

表2 浙贝母狭叶品种生物碱贝母素甲+贝母素乙含量(mg)Fig.2 Contents of alkaloids peimine a+peimine B in Fritillaria thunbergii Narrow Leaf Varieties

在不同辐射诱变剂量处理后，收集采样的浙贝母宽叶品种在1～5月份，浙贝母生物碱活性成分的贝母素甲和贝母素乙含量测定结果之和具体见表3。

表3 浙贝母宽叶品种生物碱贝母素甲+贝母素乙含量(mg)Fig.3 Contents of alkaloids peimine a+peimine B in Fritillaria thunbergii broad leaf varieties

4.2 不同品种浙贝母，采收月份为1～5月浙贝母活性生物碱测定结果

按照1～5月份的浙贝母药材采收，浙贝母的三个品种细叶、狭叶和宽叶在在不同诱变剂量的影响下，各品种的生物碱活性成分贝母素甲和贝母素乙的检测结果做成相关图示，细叶、狭叶和宽叶在1～5月的浙贝母生物碱活性成分贝母素甲和贝母素乙折线图以图2—6所示。

图2 浙贝母细叶、狭叶和宽叶在1月份含量变化图Fig.2 Variation of fine,narrow and wide leaves in Fritillaria thunbergii in January

图3 浙贝母细叶、狭叶和宽叶在2月份含量变化图Fig.3 Variation of fine,narrow and wide leaves in Fritillaria thunbergii in February

图4 浙贝母细叶、狭叶和宽叶在3月份含量变化图Fig.4 Variation of fine,narrow and wide leaves in Fritillaria thunbergii in March

图5 浙贝母细叶、狭叶和宽叶在4月份含量变化图Fig.5 Variation of fine,narrow and wide leaves in Fritillaria thunbergii in April

图6 浙贝母细叶、狭叶和宽叶在5月份含量变化图Fig.6 Variation of fine,narrow and wide leaves in Fritillaria thunbergii in May

通过对折射图2—6可知，对三个品种的细叶、狭叶和宽叶浙贝母活性物质生物碱贝母素甲和贝母素乙的HPLC-ELSD测定结果表明，各品种的浙贝母活性物质生物碱贝母素甲和贝母素乙含量跟采收的月份呈正向关系，随着采收月份的递增，各品种的活性物质生物碱贝母素甲和贝母素乙含量也相应增加，通过这一检测可知，为浙贝母在不同品种在采收季节上提供了参考意义，其中尤以5月份采摘为最佳。另外，通过对图2—6的折射图可知，浙贝母宽叶品种在1～5月份的生物碱活性成分贝母素甲和贝母素乙含量测定结果都高于另外细叶和狭叶两个品种，同时发现，通过辐射诱变育种后，浙贝母细叶、狭叶和宽叶的活性生物碱浙贝母甲和贝母素乙测定结果都远远高于未做辐射处理的对照浙贝母样品，这为浙贝母的新品种选育和核心种质构建提供一定的指导意义，为农民在种植增产增收起到了科技帮扶作用，同时也为其他农作物在辐射诱变方面提供了参考意义。