4种兽用狂犬病活疫苗的免疫效果评价

侯 巍，鲁志平，陈 斌，阳爱国，莫 茜，周明忠，尹 杰，袁东波，毛光琼，伊力军，郭 莉，杨治聪

(1.四川省动物疫病预防控制中心，四川 成都 610041；2.成都农业科技职业学院，四川 成都 611130;3.四川省眉山市动物疫病预防控制中心，四川 眉山 620020)

狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒引起的一种人兽共患的中枢神经系统急性传染病，目前对于该病尚缺乏有效的治疗手段，人患狂犬病后的病死率几近100%[1]。狂犬病病毒宿主范围广泛，犬为该病毒的主要宿主[2]。21世纪初，我国狂犬病病人逐年增加，发病数呈现逐年上升趋势[3]，直到2008年开始我国狂犬病人数逐年下降，这可能是政府部门加大了预防控制力度[4]，从而狂犬病的发病率降低。在我国，狂犬病病人中有94%是由家犬引起的[5]。对犬只接种兽用狂犬病疫苗是预防人狂犬病最好的办法[6]。为了探索有效的预防和控制狂犬病发生的重要措施，本试验对近年来四川省常用的4种兽用狂犬病(Flury株)活疫苗进行了免疫效果检测，对前期犬只狂犬病疫情防控情况更好的进行评价，为后期犬只狂犬病灭活苗的使用提供综合借鉴。

1 材料与方法

1.1 试验犬 3月龄以上，年龄相当，未免疫过狂犬病疫苗或经检测无狂犬病病毒抗体，未孕的健康犬只150只，雌雄各半，品种均为土杂犬只。四川省阆中市、蓬溪县各75只，分为10组，每组15只。

1.2 疫苗 (1)A兽用狂犬病活疫苗，批号为151206；(2)B兽用狂犬病活疫苗，批号为1603002；(3)C兽用狂犬病活疫苗，批号为2016008；(4)D兽用狂犬病活疫苗，批号为1605007。4种疫苗分别由齐鲁动物保健品有限公司、吉林正业生物制品股份有限公司、中牧实业股份有限公司、瑞普(保定)生物药业有限公司生产。

1.3 抗狂犬病抗体 ELISA 检测试剂盒 由北京世纪元亨动物防疫技术有限公司生产，96头份/盒，批号为20170304。

1.4 方法

1.4.1 试验犬分组 阆中市犬只分为Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组、Ⅴ组，蓬溪县犬只分为Ⅵ组、Ⅶ组、Ⅷ组、Ⅸ组、Ⅹ组，其中Ⅰ组、Ⅵ组免疫A疫苗，Ⅱ组、Ⅶ组免疫B疫苗，Ⅲ组、Ⅷ组免疫C疫苗，Ⅳ组、Ⅸ组免疫D疫苗，Ⅴ组、Ⅹ组为空白对照组。

1.4.2 免疫次数及剂量 各免疫组颈部肌肉注射，1头份/只，首免后1个月加强免疫1次。空白对照组不免疫。

1.4.3 免疫副反应 分别在首免、二免后对疫苗免疫组及空白对照组犬只的免疫副反应等进行记录。

1.4.4 中和抗体检测 于首免后1个月、二免后3个月、二免后10个月，分别采集试验犬只血液，分离血清，应用抗狂犬病抗体 ELISA 检测试剂盒检测血清中IgG 抗体。操作步骤：试剂盒放置室温平衡30 min；备检犬血清1∶10稀释；加入稀释好的样品，每孔100 μL。阴性、阳性对照各加1孔，临界对照加2～3孔，空白对照加1孔；置37 ℃温箱中孵育30 min；反复洗板3次；加酶标记物50 μL，置37 ℃温箱中孵育30 min；洗板3次，滴加显色液A、B各50 μL。置37 ℃避光显色10 min；每孔加终止液50 μL，混匀后以空白孔调零，用酶标仪450 nm波长测定A值。阴性对照值应≤0.10，临界对照 A 值应在 0.15～0.40，试验成立。如样品孔 A 值≥临界对照 A 值的平均值判为阳性，达到抗体保护水平；反之为阴性。世界卫生组织(WHO)规定犬只抗狂犬病抗体群体阳性率高于70%为合格，可以抵御狂犬病野毒的感染。

2 结果

2.1 免疫副反应 4种疫苗在首免和加强免疫后，4组犬只均有不同程度的免疫副反应，对照组无任何免疫副反应。其中疫苗A组30只试验犬中，有4只犬同时出现体温略微升高、精神沉郁、不愿走动、采食量下降等免疫副反应症状，免疫后第5天症状消失；疫苗B组30只试验犬中，有2只犬出现体温略微升高，4只犬出现精神沉郁、采食量下降等免疫副反应症状，免疫后第6天症状消失；疫苗C组30只试验犬中，有2只犬出现体温升高、进食异常，4只犬精神沉郁等免疫副反应症状，免疫后第3天症状消失；疫苗D组30只试验犬中，有4只犬出现体温升高、精神沉郁，2只犬进食异常等免疫副反应症状，免疫后第4天症状消失，见表1。同时对阆中市、蓬溪县两地试验犬只，按照不同免疫疫苗组分别进行免疫副反应统计，不同疫苗组免疫副反应在区域间比较无显著差异(P>0.05)，如图1。试验过程中未出现因疫苗免疫副反应造成的犬只死亡情况。

表1 不同疫苗在首免、二免后未出现免疫副反应情况统计Table 1 Side effects statistic of four vaccines post first and second immunization (只)

图1 不同地区免疫副反应比较Fig.1 Immunological side effects comparison of different zones

2.2 中和抗体检测

2.2.1 首免前免疫抗体检测 首免前应用ELISA 检测法分别对阆中市、蓬溪县的150只犬只进行狂犬病抗体检测，全部为抗体阴性，符合所需试验动物要求。

2.2.2 中和抗体比较 各检测期检测结果，临界对照A值的平均值在0.25～0.27。各组不同检测时期抗体水平合格犬只数量见表2。首免后1个月(即加强免疫前)分别对所有疫苗免疫组、空白对照组试验犬只进行采血，检测狂犬病疫苗中和抗体，阆中市、蓬溪县疫苗组犬只免疫抗体群体阳性率比较差异不显著(P>0.05)；二免后3个月，两地犬只群体阳性率比较差异不显著(P>0.05)；二免后10个月二者差异不显著(P>0.05)；分别与首免前比较差异显著(P<0.05)。见表2。

表2 不同区域间试验犬组中和抗体阳性率的比较Table 2 Neutralizing antibody positive rate comparison of test dogs group in different zones (只)

2.2.3 免疫抗体组间比较 疫苗试验组犬只免疫抗体在首免前与空白对照组比较无显著差异(P>0.05)；在免疫后各检测期，疫苗A犬只群体阳性率相比其他3种疫苗相比差异显著(P<0.05)，同种疫苗各检测期比较差异显著(P<0.05)，同种疫苗不同组间比较，差异不显著(P>0.05)，见表3。

表3 同种疫苗中和抗体组间比较Table 3 Neutralizing antibody comparison between 4 groups (只)

2.2.4 免疫抗体消长情况 根据4个不同疫苗组首免前、首免后1个月、二免后3个月、二免后10个月试验犬只血清狂犬病免疫抗体群体阳性率，见表4，A、B、C、D四种疫苗免疫犬只后均能在首免后1个月达到有效保护水平，二免后3个月4种疫苗组犬只抗体群体阳性率均处于上升水平，与首免后1个月分别比较，差异显著(P<0.05)；二免后10个月疫苗A、B、C组犬只群体阳性率仍然处于有效保护水平，说明首免1个月后加强免疫，免疫保护水平至少达10个月，D组犬只达不到10个月。同时，根据本次试验检测数据，从中筛选出最适疫苗A。

3 讨论

试验所采用的4种疫苗免疫犬只后，均对少量犬只有不同程度的免疫副反应，出现的免疫副反应症状以出现短暂的体温略微升高、精神沉郁、不愿走动、采食量下降为主要免疫副反应症状，上述反应均在1周以内逐步恢复正常，试验过程中未出现因疫苗免疫副反应造成的犬只死亡情况，说明4种疫苗在临床应用过程中均较为安全。

试验的4种疫苗毒株均为Flury株，Flury株是由美国科学家于1939年分离的狂犬病病毒Flury株经鸡胚和细胞传代演变而来的弱毒疫苗株[7]，由此制备的犬用狂犬病疫苗效果确切，但不同生产厂家在疫苗制备工艺及质控等方面存在差异，导致不同厂家生产的疫苗间在实际应用中效果不同。

采集犬只血清样品受各种因素影响，未开展加强免疫后更多频次的采样检测工作，免疫后各时期的检测数据尚欠缺，只开展了首免1个月、二免后3个月、二免后10个月的检测，无法进行更加详细的数据分析，从几次的抗体检测情况来看，各疫苗二免后3个月犬只免疫抗体群体阳性率接近峰值水平，后逐步回落，但二免后10个月疫苗A、B、C组群体合格率仍然处于有效保护水平，高于WHO规定犬只免疫抗体群体阳性率70%的标准，同时，抗体阳性犬只A值均在2～2.5，明显高于临界值A平均值0.26。

表4 不同疫苗中和抗体组间比较Table 4 Neutralizing antibody comparison of 4 groups (只)

试验过程中，阆中、蓬溪两地犬只未进行犬只年龄、品种、性别等方面的分类，但从本次试验结果来看，疫苗安全性和免疫效果与试验犬只的年龄、品种及性别等方面不存在明显的联系，也说明犬只的年龄、品种、性别对本次试验结果未造成明显影响。

根据历史检测数据，每年单次免疫，有效保护期为3个月左右，从本次试验对近年来全省犬只按照一年2次颈部肌肉注射、1头份/只、间隔期1个月的免疫效果评价来看，表明加强免疫对于提高犬只抗狂犬病抗体水平及群体阳性率起到切实效果，表明四川省针对犬只狂犬病近年来采用的免疫方法是行之有效的，也为后期采用狂犬病灭活疫苗的推广使用提供参考。