伏立康唑单独或联合硝苯地平对茄病镰刀菌复合体及白念珠菌的体外抗菌活性研究

陈晓莲?丁辉?刘红山?何宏?胡献铝?钟兴武

【摘要】目的 测定伏立康唑对临床分离的茄病镰刀菌复合体和白念珠菌的抗菌效果，并分析其与钙通道阻滞剂硝苯地平联合使用的抗菌效果。方法 参照美国临床实验室标准化委员会的M27-Ed4及M38-A3方案，采用微量液体稀释法测定单独使用伏立康唑、硝苯地平对30株茄病镰刀菌复合体和15株白念珠菌的最低抑菌浓度（MIC），采用棋盘法测定药物联合使用的抗真菌效果。结果 伏立康唑对茄病镰刀菌复合体和白念珠菌的MIC范围分别是0.25 ～ 8.00 μg/ml与2.00 ～ 64.00 μg/ml。伏立康唑联合应用硝苯地平时，对所有的茄病镰刀菌复合体（30/30）无协同效应，无拮抗效应;对86.7%（13/15）的白念珠菌有协同效应，对所有菌株无拮抗效应，药物敏感性增加（P < 0.001）。结论 伏立康唑联合应用硝苯地平可增加白念珠菌对伏立康唑的药物敏感性，有协同效应，对茄病镰刀菌复合体无协同效应，无拮抗效应。

【关键词】伏立康唑;硝苯地平;真菌性角膜溃疡;微生物敏感试验;

茄病镰刀菌复合体;白念珠菌

Evaluation of in vitro antifungal effect of voriconazole or voriconazole combined with nifedipine against F.solani. and C.ablibans. Chen Xiaolian， Ding Hui， Liu Hongshan， He Hong， Hu Xianlyu， Zhong Xingwu.

Clinical Laboratory of Hainan Eye Hospital and Key Laboratory of Ophthalmology， Zhongshan Ophthalmic Center， Sun Yat-sen University， Haikou 570311， China

Corresponding author， Zhong Xingwu， E-mail： zhongxwu@ mail. sysu. edu. cn

【Abstract】Objective To evaluate in vitro antifungal effect of voriconazole or voriconazole combined with nifedipine against clinically isolated F.solani. and C.ablibans. Methods According to the M27-Ed4 and M38-A3 schemes proposed by Clinical and Laboratory Standards Institute （CLSI）， the minimum inhibitory concentration （MIC） of voriconazole and nifedipine on 30 strains of F.solani. and 15 strains of C.ablibans. was measured by the microdilution method. The antifungal effect of the combination of two drugs was assessed by the checkerboard method. Results The MIC ranges of voriconazole against F.solani. （30 strains） and C.ablibans. （15 strains） were 0.25-8.00 μg/ml and 2.00-64.00 μg/ml， respectively. When applied in combination with nifedipine in vitro， there was no synergistic effect or antagonistic effect on all F.solani. strains （30/30）. There was synergistic effect on 86.7% （13/15） of C.ablibans. strains， whereas no antagonistic effect on all C.ablibans. strains. The drug sensitivity was significantly enhanced （P < 0.01）. Conclusion Nifedipine can increase the drug sensitivity of C.ablibans. to voriconazole， which has a synergistic effect. It exerts no synergistic or antagonistic effect on F.solani.

【Key words】Voriconazole.;Nifedipine;Fungal keratitis;Microbial sensitivity test;F.solani;

C.ablibans

眼部真菌感染中的真菌性角膜潰疡是高致盲性眼病[1]。镰刀菌是真菌性角膜溃疡的主要致病菌，白念珠菌亦是真菌性角膜溃疡的致病菌。由于镰刀菌对氟康唑的固有耐药特性，临床上常用安全、有效和低毒的伏立康唑来进行抗镰刀菌的治疗[2-5]。然而，随着抗真菌药物在临床的广泛应用，耐药现象不断出现。因此，我们需要寻找新的抗真菌药物和降低抗真菌药物耐药性的方法。

新药研发与联合用药的创新应用是抗真菌治疗的2个重要途径，而联合用药比研发新药更快捷，具有较高的时效性，因此备受关注。钙通道阻滞剂（CCB）通常用于抗心律不齐，可阻断影响细胞钙调蛋白系统的钙离子内流，从而调节机体的新陈代谢和生长。大量的研究表明，非抗真菌类药物在与氟康唑联合应用后可提高耐药白念珠菌的药物敏感性[6]。研究显示，氟康唑联合CCB在抗白念珠菌、新型隐球菌等真菌治疗中取得了一定的进展[7]。然而伏立康唑与CCB联合应用对镰刀菌的抗菌效果尚有待探索，因此在本研究中，我们通过体外药敏实验评价了伏立康唑单独或联合硝苯地平对临床分离茄病镰刀菌和白念珠菌的抗菌活性，现将结果报告如下。

材料与方法

一、材 料

1.实验菌株

本研究所用30株茄病镰刀菌复合体均分离自海南省眼科医院临床确诊的真菌性角膜溃疡患者，菌株经过形态学及分子生物学鉴定，保存于海南省眼科医院检验科微生物室-80℃低温冰箱中，实验前于恒温箱中解冻复苏后在马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）斜面于35℃培养48 ～ 72 h，后于28℃培养7 d。15株白念珠菌均分离自海南省眼科医院临床确诊的真菌性角膜溃疡患者，菌株经过形态学及分子生物学鉴定，于-80℃冰箱保存备用，实验前于恒温箱中解冻复苏然后在酵母膏胨葡萄糖（YPD）琼脂培养基上传代2次各培养24 h。

2.抗真菌药物与主要试剂

伏立康唑（批号：S0701AS），硝苯地平（批号：S1222AS），购自美仑生物，药物以分析纯级二甲基亚砜（DMSO）溶解成储存液，浓度均为1600 μg/ml。RPMI-1640培养基（GIBCO）、马铃薯葡萄糖琼脂培养基、酵母膏胨葡萄糖、碳酸氢钠、葡萄糖、三氮吗啡啉丙磺酸钠（MOPS）均购自广州威佳科技有限公司。

二、方 法

1. 微量液体稀释法测单独用药最低抑菌浓度（MIC）

参考美国临床实验室标准化委员会（CLSI）的M27-Ed4及M38-A3方案，配制经MOPS缓冲（pH = 7.0）的2%葡萄糖RPMI-1640液体培养基，过滤灭菌[8-9]。茄病镰刀菌的菌液配制：无菌生理盐水收集孢子，使用光线路径1 cm比色杯，波长530 nm，光密度0.15 ～ 0.17，悬液以RPMI-1640液体培养基再稀释50倍，到终浓度的2倍，致接种终浓度为（0.5 ～ 5.0）×104 CFU/ml;白念珠菌的菌液配制：挑取单个较大菌落，用无菌生理盐水配成0.5麦氏单位的菌液，涡旋震荡15 s，用RPMI-1640液體培养基进一步稀释50倍后再以1∶20稀释，最终的菌浓度为（0.5 ～ 2.5）×103 cells/ml。伏立康唑和硝苯地平经RPMI-1640液体培养基稀释为2倍终浓度的倍减系列浓度，伏立康唑的浓度为0.12 ～ 64.00 μg/ml，硝苯地平浓度为1.00 ～ 512.00 μg/ml，药液按照浓度从低到高分别加入到96孔板的1至10孔，每孔100 μl;不同的板每孔分别加入配好的茄病镰刀菌和白念珠菌菌液各100 μl，同时设立生长对照（无药物孔）和阴性对照（无菌孔）;茄病镰刀菌的板于35℃孵育48 h，白念珠菌的板于35℃ 孵育24 h，孵育过程中避免晃动，肉眼观察判读结果，对镰刀菌的MIC判断标准为肉眼观察到的与生长对照相比100%的生长抑制;对白念珠菌的MIC判断标准是50%抑制的最低药物浓度为伏立康唑的MIC，硝苯地平为100%的生长抑制。所有药敏试验均重复操作2遍。药敏质控菌株为近平滑念珠菌ATCC 22019。

2. 体外联合药物敏感性

采用棋盘法测试体外联合药物敏感性。在96孔板中分别加入不同浓度的2种药物。每孔加入4倍终浓度的药物倍比稀释液各50 μl，第1 ～ 10列分别加入浓度从低到高的伏立康唑，药物终浓度为0.03 ～ 16.00 μg/ml;第H ～ A行分别加入浓度从低到高的硝苯地平至终浓度为0.50 ～ 64.00 μg/ml。同时设立生长对照（不含药液只有菌液）和空白对照。接种时除空白对照孔外其余各孔均加入100 μl的2倍终浓度菌悬液，茄病镰刀菌和白念珠菌板的孵育时间及结果判读同单个药物的MIC测定。部分抑菌浓度指数（FICI）判定：与生长对照孔相比，生长100%抑制所对应的最低药物浓度，包括各药物单独和联合时的MIC值。联合用药时各药物的MIC分别除以单独用药时MIC商的和，即FICI = MICA联合/MICA单独+MICB联合/MICB单独。药物之间相互作用如下：FICI≤0.5为协同作用，> 0.5且≤4为无相互作用，> 4为拮抗作用。

三、统计学处理

使用SPSS 22.0处理数据，研究指标为等级资料，用n（%）表示（n为菌株数），2组差异比较采用Wilcoxon秩和检验，P < 0.05为差异有统计学意义。

结果

一、质控菌株体外药敏结果

伏立康唑对质控菌株ATCC22019的MIC为0.125 μg/ml，在参考范围内，表明实验操作及结果可信。

二、实验菌株单独用药的药敏结果

单独用药MIC如下，伏立康唑、硝苯地平对茄病镰刀菌复合体MIC范围分别为0.25 ～ 8.00 μg/ml和64.00 ～ 512.00 μg/ml;对白念珠菌的MIC范围分别为2.00 ～ 64.00 μg/ml和64.00 ～ 256.00 μg/ml。

三、实验菌株联合用药的药敏结果

伏立康唑与硝苯地平联合应用时，对所有的茄病镰刀菌复合体（30/30）既无协同效应，也无拮抗效应（表1）;对86.7%的白念珠菌（13/15）有协同效应，对所有白念珠菌无拮抗效应（表2）。

四、镰刀菌复合体抗菌药物有效性比较

单独使用伏立康唑、联合使用硝苯地平对茄病镰刀菌的敏感、中介、耐药情况相同，总有效率均为46.7%，2组有效性差异无统计学意义（P > 0.05，表3）。

五、白念珠菌抗菌药物有效性比较

单独使用伏立康唑时，白念珠菌敏感、中介、耐药的比例分别为0.0%、6.7%、93.3%，总有效率为6.7%，联合使用硝苯地平时，白念珠菌敏感、中介、耐药的比例分别为0.0%、100.0%、0.0%，总有效率为100.0%，联合使用硝苯地平有效性明显优于单独使用伏立康唑，差异有统计学意义（P < 0.001，表4）。

讨论

真菌性角膜溃疡是以农业为主地区高发的高致盲性眼病。受限于眼科临床上局部使用抗真菌药物较少且致病真菌耐药性逐渐增加的困难，探索联合应用不同类型药物、提高抗真菌药物有效性的研究备受关注，除不同抗真菌药物联合应用外，与非抗真菌药物的联合应用在一些真菌如白念珠菌、烟曲霉菌等的药物敏感性研究中已获得一定的进展[10-12]。然而作为真菌性角膜溃疡最常见致病菌茄病镰刀菌，其体外联合药物敏感性研究却较为局限，使临床治疗的药物选择受到制约[13-15]。

目前，鉴于各种药物的眼部毒性作用差异，眼科临床常用的抗真菌药物主要为唑类及多烯类抗真菌药物，其中唑类抗真菌药物的作用机制是通过抑制真菌麦角固醇合成而发挥抑菌作用，常用药物包括氟康唑及伏立康唑。以往的研究表明，镰刀菌对氟康唑存在固有耐药，因此常选用伏立康唑做为真菌性角膜溃疡的唑类药物治疗补充[16-17]。本研究中伏立康唑对茄病镰刀菌及白念珠菌的MIC范围分别为0.25 ～ 8.00 μg/ml和2 ～ 64 μg/ml，抑菌有效率分别为46.7%和6.7%，表明茄病镰刀菌对伏立康唑的药物敏感性高于白念珠菌，此结果与以往的研究结果一致[5]。然而两者的抗菌药物有效率也同时表明茄病镰刀菌和白念珠菌对伏立康唑均具有一定的耐药性。以往的研究表明，相较于镰刀菌属的其他非茄病镰刀菌株，茄病镰刀菌对抗真菌药物的耐药性更高，在对不同抗真菌药物的敏感性比较中，如伊曲康唑、伏立康唑、泊沙康唑、两性霉素B、那他霉素及卡泊芬净等抗真菌药物的体外药敏实验表明，在以上抗真菌药物中，相较于非茄病镰刀菌的其他镰刀菌属菌株，茄病镰刀菌对伏立康唑的耐药性更高[18-20]。本研究与以往的研究结果均体现了真菌性角膜溃疡病原菌株药物敏感性差、治疗难度大、预后差的特点。

由于唑类抗真菌药物主要表现为抑菌作用，而非杀菌作用，因此，对易感人群长期使用唑类化合物进行预防或治疗可发生自然选择导致耐药菌株增加[21]。提高耐药菌株的药物敏感性是除新药研制以外可行性高的抗真菌治疗途径。细胞内的钙稳态维持与钙离子介导的细胞信号传导与诸多细胞膜结构的功能有关，其中尤为重要的是内质网的功能，维持内质网和细胞内钙稳态直接影响着真菌细胞的形态、菌丝的发育、生物膜的形成及毒力。因此CCB作为可干扰钙离子分泌系统的药物可直接影响真菌细胞的病原特性[22]。而且真菌细胞所具有的进化上高度保守的信号传导通路使其成为了药物研究的作用靶点[21]。CCB对白念珠菌、烟曲霉等多种真菌具有抑制作用，对白念珠菌的黏附、定植、菌丝形成和生物膜的形成均具有抑制作用[10-12， 23-24]。CCB硝苯地平与酮康唑、氟康唑联合使用时，均可发挥对白念珠菌及光滑念珠菌的有效协同作用，并且可以降低耐药白念珠菌对氟康唑的耐药性[25]。

本研究中单独应用硝苯地平对茄病镰刀菌无抑制作用，联合伏立康唑仍無协同效应产生。然而对白念珠菌却有协同效应产生，并且药物协同效应主要表现在耐药菌株，研究结果显示MIC高的菌株协同效应强，联合用药后MIC下降倍数为1 ～ 512倍，抗菌药物抑菌有效率显著提升，表明了硝苯地平存在可以提高耐药白念珠菌对伏立康唑药物敏感性的可能。Liu等（2018年）的研究显示，当氟康唑与包括硝苯地平在内的4种CCB联合应用时，对耐药型白念珠菌均具有协同作用，但对敏感型菌株无协同作用，其机制为氟康唑联合氨氯地平可引起编码钙调磷酸酶的钙调磷酸酶催化亚基（CNA1）和钙调磷酸酶调节亚基（CNB1）及编码液泡膜钙通道蛋白YVC1下调，从而影响外排泵功能，钙离子浓度升高抑制真菌生长。Alnajja等（2018年）的研究证实，与维拉帕米及尼卡地平等CCB通过作用于外排泵产生抗真菌协同效应不同的是，硝苯地平对外排泵过表达或缺乏的光滑念珠菌均有抗菌药物协同作用，推断硝苯地平发挥协同效应的作用机制与外排泵的表达无关。由此可见，相同类型的CCB对耐药性不同的相同菌株作用不同，同时，即使是同类型的不同药物对相同菌株的作用亦有差异。此外，真菌的耐药性与生物膜的形成有关，无论是CCB或抗真菌药物均可能参与抑制真菌生物膜的合成过程。Chandra等（2009年）及Córdova-Alcántara等（2019年）的研究表明镰刀菌与白念珠菌的生物膜形成存在差异，这也决定了耐药性存在巨大差异。

需要提出的是，Mishima等（2017年）使用硝苯地平药物降血压同时应用伏立康唑治疗严重真菌感染时患者出现低血压临床表现，原因为伏立康唑作为三唑类药物，其可抑制细胞色素P4503A4酶（CYP3A4）的活性，从而抑制硝苯地平的代谢，升高其血药浓度，加强降压作用，故在临床上系统性联合应用2类药物时需对血压进行严密监控。本研究通过体外实验对联合用药的有效性进行验证，为临床应用提供理论依据，对于眼局部联合用药的系统安全性研究尚需进一步完善。

综上所述，本研究结果表明联合应用硝苯地平可增加白念珠菌对伏立康唑的药物敏感性，具有协同效应，而对茄病镰刀菌复合体无协同效应产生，亦无拮抗效应。此结果与以往研究不同菌株及不同药物联合使用的结果有所区别，进一步丰富了真菌性角膜溃疡主要致病菌株的体外药物敏感性研究结果，进一步的机制探讨将为真菌的耐药性研究提供理论依据，为临床真菌性角膜溃疡的治疗提供参考。

参 考 文 献

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（收稿日期 ：2020-07-03）

（本文編辑：洪悦民）