基于近红外光谱的茶叶中粗纤维快速测定方法研究

张 帆 耿 响 张 恒 万明轩

(1.南昌海关技术中心，江西 南昌 330038；2.江西省红外光谱应用工程技术研究中心，江西 南昌 330038)

0 引言

茶叶起源于中国，中国人饮茶的历史长达四千多年，茶叶与人们的生活紧密相关[1-2]。近年来，茶叶的消费水平不断提高，人们对茶叶的品质要求也越来越高。茶叶中含有茶多酚[3]、茶多糖、茶氨酸等多种有效成分，许多研究表明茶叶中的这些有效成分具有抗氧化、降血压、降血脂、降血糖、提神、预防蛀牙等多种功效。茶叶的粗纤维含量可作为鉴别茶叶老嫩以及评定成品茶等级的国际公认标准，多项研究指出，茶叶的粗纤维含量直接影响到茶叶的品质，因此对茶叶粗纤维的研究具有重要意义。

粗纤维的测定方法包括重量法、滤袋法和纤维素分析仪测定法。重量法是样品经酸消化、碱消化后，再过滤烘干灰化，通过计算前后两次质量之差进一步计算样品中粗纤维含量的方法[4]。此方法中时间对酸碱消化影响较大，要严格控制，过程中应注意补加热水保持原溶液体积不变，该方法操作简单，但周期较长，人为因素影响较大。整个实验周期长达2天。滤袋法具有简洁方便、高效精准等特点。此技术目前较多的应用于饲料与食品中粗纤维、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维的测定。其与经典重量法相比，在酸消化、碱消化过程中节省了抽滤过程，节省了时间，且操作简单。缺点是制样过程要严格控制粉碎样品颗粒度大小，样品粉碎过细时，会导致滤袋在加热过程中，一些样品颗粒会从滤袋中流出，影响样品粗纤维含量结果。纤维素分析仪测定法比较适用于成批样品的集中测定，较之重量法，节省人力，操作方便，周期短，但检测成本大大提高。

近年来，近红外光谱技术由于其操作简单、检测速度快、绿色环保等优点，与传统检测方法相比，具有明显优势，在食品、轻工、制药、环保等各个领域开展了定性分析、定量分析和在线分析。刘辉军[5]和胡新军[6]分别研究了利用近红外光谱技术测定茶叶中茶多酚含量，均建立了较好的近红外快速检测茶多酚含量的近红外分析模型。2003年，Luypaert等[7]利用偏最小二乘法，建立了绿茶样品完整茶叶和粉碎处理后叶片的总抗氧化能力的近红外定量模型。模型可同时测定完整茶叶和粉碎后茶叶的咖啡因、表没食子儿茶素、没食子酸值和表儿茶素，结果表明完整叶片的四个成分模型的相关性除EC(r=0.83)外，其余均高于0.9。2004年，孙耀国等[8]采集了70多个具有完整叶片绿茶样品的近红外光谱，选择最有波长后利用偏最小二乘法建立了茶多酚、氨基酸和咖啡碱的近红外校正模型。Nakamura等[9]利用近红外光谱分析技术对绿茶饮料中儿茶素、表儿茶素没食子酸酯等多种儿茶素单体含量测定方面进行了相关研究。吴彦红等[10]使用带有透射样品池的近红外光谱仪采集茶汤样品的近红外光谱，结合间隔偏最小二乘和联合区间偏最小二乘法提取样品的近红外光谱中的氨基酸等指标的特征波段，分别建立近红外模型。该研究为现场快速分析液体茶饮料中的多种成分提供技术支撑。2015年，张民[11]通过鲜茶叶中茶多酚和氨基酸含量，建立了高光谱判定鲜茶叶品质的分析模型。

已有近红外对茶叶的研究主要是对茶叶中的茶多酚、氨基酸、咖啡碱以及抗氧化能力的评价和比较，利用近红外研究茶叶中粗纤维含量的方法暂未查询到。本文介绍一种近红外快速检测茶叶中粗纤维含量的方法，以提高茶叶中粗纤维的检测速度。

1 材料与方法

1.1 实验仪器

试验采用步琦公司的傅立叶近红外光谱仪(NIRFlex N-500型)，波段范围为10000～4000cm-1。试验条件：采用XL附件装样，设置扫描次数32次，分辨率8cm-1，实验室温度25℃，湿度56-60%，利用仪器自带反射板，压在样品上，整个试验装置固定在光学防震平台上，保证仪器系统不受外界振动的影响。

图1 步琦NIRFlex N-500近红外光谱仪

1.2 试验样品

本实验以本单位接受的委托茶叶样品共135个为研究对象。利用GB/T 8310-2013重量法测定样品的粗纤维含量，含量范围为7.29-15.94%。

1.3 样品颗粒度确定

颗粒度是样品经粉碎机粉碎处理过筛后，样品粒径的大小。茶叶样品经粉碎处理后，采集其近红外光谱。样品的颗粒度越大，样品颗粒间的孔隙越大，进行光谱采集时，近红外光会穿过样品间孔隙造成光谱的损失，进而会影响光谱信息的准确性。样品颗粒度越小，样品颗粒间的孔隙越小，相比之下，光谱稳定性会较好，但也会受到光程的影响，会导致噪声增大，影响近红外光谱的质量。所以，选择最佳的样品颗粒度对近红外结果的分析尤为重要。

本试验为确定最佳的样品颗粒度，随机选取3份茶叶样品，分别按粒径0.5mm和1.0mm经粉碎机制样，得到两组待测样品，使得扫描光谱时样品厚度为4mm，扫描次数为32次，分别对两组样品在波数4000～10000cm-1内进行近红外光谱扫描，每组样品平行测定6次，每次测定时重新装样，最终得到扫描数据，通过计算样品在各波数反射率的标准偏差确定最佳样品颗粒度，图1给出的是1号茶叶样品在两种颗粒度下的标准差比较，颗粒度为0.5mm时标准差较小，即光谱稳定性较好，所以选择颗粒度为0.5mm。

图1 1号茶叶样品不同颗粒度下标准差比较

1.4 样品装填厚度确定

装填厚度是指采集样品的近红外光谱时，装填在样品池中的厚度，也可称作扫描光程[7]。对样品进行光谱采集时，样品的装填厚度对光谱有一定的影响。装样太薄，会导致样品松散地铺在样品池中，均匀性较差，当对样品进行扫描时，无法获得样品的完整信息，也会造成光能量损失。但装样太厚，会对样品造成一定程度的浪费，更重要的是会使光谱噪声加大，干扰测定结果。所以，选择最适合的填装厚度是很重要的。

随机选择2个茶叶样品，样品颗粒度为0.5mm，扫描次数为32次，分别按填装厚度2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm进行装样，同时保证每个样品在一致的温湿度条件下，在4000～10000cm-1的波数范围内采集样品的近红外光谱，每个装填厚度下做6次平行实验，每次实验时重新装样。计算6次样品近红外光谱的标准偏差，如图2和图3。从图2中可以看出：当装填厚度为2mm时标准偏差最大，且波动幅度也增大；当装填厚度为3mm时标准差依然较大，但波动幅度变小；当装填厚度为4mm及以上时，标准差明显减小，而且随着波数的增加，波动幅度较稳定。从图3中可以看出：当装填厚度为2mm、3mm时，标准偏差较大，波动幅度也较大。当厚度增加到4mm时，标准差明显减少，继续增加到5mm、6mm、7mm时，标准偏差波动幅度和4mm时差别不大。

图2 茶叶样品1在不同装填厚度下的标准差

通过图2、图3综合分析：使用近红外仪器采集茶叶的近红外光谱时，具有最佳的样品装填厚度，厚度至少需要4mm。为了在保证采集光谱稳定的基础上，尽可能节省样品用量，本试验采用4mm作为茶叶样品的最佳装填厚度。

图3 茶叶样品2在不同装填厚度下的标准差

1.5 样品近红外光谱采集

在相同的温湿度条件下，近红外光谱仪扫描次数为32次，分辨率为8cm-1，样品池中样品的装填厚度为4mm，样品颗粒度为0.5mm，波数范围为4000～10000cm-1，采集135个茶叶样品的近红外光谱。为了减少人为因素影响，每个样品重新装样3次，采集光谱，取3条光谱的平均作为模型建立的光谱数值。135个茶叶样品的近红外光谱见图4。

2 模型建立与分析

2.1 模型建立

利用近红外光谱仪配备的数据处理软件NIR-CAL对135个茶叶样品的近红外光谱进行数据预处理和模型建立。利用偏最小二乘法，结合国标方法测定的样品的粗纤维含量，建立茶叶中粗纤维的近红外定量模型，校正集和预测集的样品个数分别为85和50，通过相关系数法选择4500～6200cm-1、6800～8000cm-1范围作为模型建立的最佳波段，表1中给出了不同预处理后所建立的近红外模型的比较。

图4 135个茶叶样品的近红外光谱图

从表1中可以看到，样品的近红外光谱经过归一化、一阶导数和9点平滑处理后，所建立的校正模型，其校正相关系数Rc和验证集相关系数Rp最大，校正均方根误差SEC与预测均方根误差SEP最小，且较为接近，表明归一化、一阶导数和9点平滑的预处理效果最好。

表1 不同预处理方法的模型参数

2.2 模型分析

应用相对分析误差RPD对所建立的近红外分析模型的预测精确度、准确性和稳定性进行评价，茶叶中粗纤维近红外定量模型校正集和验证集的相对分析误差结果见表2。

表2 NRS粗纤维定量分析模型的校正与验证结果

从表2可以看到，茶叶中粗纤维含量的校正集和验证集的相关系数均在0.95以上，具有很好的线性相关性；相对分析误差RPD均大于3，说明模型具有较好的预测准确性。

为验证模型的准确性和实用性，用60个未参加建模的茶叶样品进行测试，得到模型预测结果。计算60个样品的模型预测结果与国标方法实验结果的绝对误差，均小于国标方法测试结果的10%，说明近红外方法的精密度较好，该依据是国标方法要求在重复条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不超过算术平均值的10%。另一方面对模型预测结果与国标方法的测试结果进行成对结果t检验，得到t(60，0.05)=-1.35<临界值T=2.00，说明近红外方法与国标方法不存在显著差异。

3 结论与展望

本研究以茶叶中粗纤维的国标方法为参考方法，首先确定了茶叶样品的颗粒度和装样厚度，利用偏最小二乘法建立了茶叶中粗纤维的近红外模型，通过外部样品验证，证明了所建立的模型的准确性和稳定性，可得到如下结论及对下一步工作的展望：

1)近红外方法无需化学试剂、速度快，可将国标方法几个小时才能完的实验缩短为1分钟，显著缩减了检测周期，为大批量抽检和企业的自检自控提供了技术支撑；

2)为实验操作更加简单便捷，本课题组正在开发近红外快速测定茶叶专用采样附件，以进一步提高检测效率，减少人为装样误差；

3)本研究将进一步开发茶叶中儿茶素、茶多酚等多个指标的近红外方法，力争实现茶叶品质指标的全覆盖。